摘 要：主要探討蛋白酶種類及水解時(shí)間對(duì)豬血漿蛋白水解物抗氧化活性以及乳化能力的影響。采用3種蛋白酶（堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶）對(duì)豬血漿蛋白分別水解20、40、60、80、120 min。測(cè)定豬血漿蛋白水解物的抗氧化活性、乳化活力、乳化穩(wěn)定性以及分子質(zhì)量的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明：相對(duì)于木瓜蛋白酶和中性蛋白酶來說，堿性蛋白酶能夠顯著提高豬血漿蛋白水解物的還原能力、ABTS+·和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力（P<0.05），而且堿性蛋白酶水解60 min時(shí)所獲得的豬血漿蛋白水解物具有最高的乳化活力和乳化穩(wěn)定性（P<0.05）。另外，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，豬血漿蛋白水解物中小于5 kD的成分顯著增加（P<0.05），且堿性蛋白酶對(duì)豬血漿蛋白的酶解效果最佳（P<0.05）。上述結(jié)果表明，堿性蛋白酶適度水解豬血漿蛋白以后獲得的水解物同時(shí)具有良好的抗氧化活性和乳化能力。

關(guān)鍵詞：豬血漿蛋白；水解物；抗氧化活性；乳化特性；適度水解

Abstract： The effect of different hydrolysis times and type of protease on the antioxidant activity and emulsifying activity of porcine plasma protein hydrolysates （PPPH） was investigated. Porcine plasma protein was hydrolyzed with three different commercial proteases （alcalase， neutral protease and papain） for 0 to 120 min. The antioxidant activity， emulsifying activity index （EAI）， emulsion stability index （ESI） and molecular weight distribution of the hydrolysates were evaluated. The results showed that compared with neutral protease and papain， the PPPH prepared with alcalase rendered the highest antioxidant activity （reducing power， ABTS+· radical-scavenging activity and DPPH radical-scavenging activity） （P < 0.05）. Moreover， the hydrolysate prepared by alcalase hydrolysis for 60 min showed the highest EAI and ESI （P < 0.05）. The proportion of less than 5 kD was significantly increased with increasing hydrolysis time （P < 0.05）， and the alcalase provided the best hydrolysis efficiency （P < 0.05）. Therefore， these results demonstrated that modest hydrolysis by alcalase could yield PPPH with higher antioxidant capacity and emulsifying properties， which can be used as a potential additive in the food industry.

Key words： porcine plasma protein； hydrolysates； antioxidant properties； emulsify properties； moderate hydrolysis

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.12.002

中圖分類號(hào)：TS251.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）12-0007-05

引文格式：

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當(dāng)前，利用不同的動(dòng)植物蛋白開發(fā)功能性多肽已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。已有大量的研究表明將蛋白質(zhì)用適當(dāng)?shù)拿杆夂螅a(chǎn)生的蛋白水解物具有很好的抗氧化活性。許多蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后都會(huì)產(chǎn)生具有抗氧化活性的抗氧化肽，已有的研究包括有乳清蛋白[1-3]、玉米蛋白[4]、卵白蛋白[5]、肌肉蛋白[6]、大豆蛋白[7]、馬鈴薯蛋白[8]以及蕎麥蛋白[9]等。但是過度的水解會(huì)嚴(yán)重破壞水解物的乳化性質(zhì)，使蛋白水解物不能廣泛地應(yīng)用到食品加工中。然而，適度酶解的方法能夠使蛋白質(zhì)獲得一定的抗氧化活性和較好的乳化性[10]。適度水解的蛋白質(zhì)相對(duì)于未水解蛋白來說，能夠在一定程度上改善其自身的乳化活性，主要?dú)w因于長(zhǎng)肽鏈靈活可變的構(gòu)象以及由于水解而暴露出來的疏水核心[11]。

豬血是現(xiàn)代肉業(yè)的主要副產(chǎn)品之一，具備資源豐富、價(jià)格便宜、吸收利用率高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種潛在的營(yíng)養(yǎng)和功能性蛋白來源。一些研究已經(jīng)表明，豬血漿蛋白可作為功能性成分的蛋白酶抑制劑和肉、魚糜制品的填充料，并可被人類安全食用，但過度水解嚴(yán)重破壞了豬血漿蛋白的一些功能特性，使其應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制[12]。因此，生產(chǎn)兼具抗氧化活性和改進(jìn)功能特性的蛋白水解物具有經(jīng)濟(jì)利益和生產(chǎn)意義。本研究以3 種蛋白酶對(duì)豬血漿蛋白分別水解20、40、60、80、120 min，測(cè)定豬血漿蛋白水解物的抗氧化能力、乳化能力和分子質(zhì)量的變化趨勢(shì)，考察酶的種類及水解時(shí)間對(duì)豬血漿蛋白的不同酶解產(chǎn)物的抗氧化能力和乳化特性的影響，為制備出同時(shí)具有高抗氧化活性和高乳化性的豬血漿蛋白水解物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血漿蛋白粉 黑龍江北大荒肉類有限公司；堿性蛋白酶 丹麥Novozymes公司；中性蛋白酶、木瓜蛋

白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；九三一級(jí)大豆色拉油 哈爾濱九三油脂。

十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS） 美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、鹽酸、冰乙酸、乙酸鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、過二硫酸鉀、

2，2-聯(lián)氨-雙二胺 哈爾濱市萬太生物藥品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；

AL-104型精密電子天平、FE20K型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海

驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新徑儀器有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；TU-1800紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血漿蛋白水解物的制備

根據(jù)Liu等[13]的方法將加熱處理（95 ℃，5 min）的豬血漿蛋白水溶液（4 g/100 mL）分別與3 種蛋白酶作用20、40、60、80、120 min，酶與底物質(zhì)量比為2∶100，反應(yīng)過程中不斷加入1 mol/L的NaOH，使pH值保持不變。水解結(jié)束后95 ℃水浴5 min進(jìn)行滅酶，然后用1 mol/L

HCl將水解液pH值調(diào)至7.0。各水解物以9 000×g離心10 min除去不溶顆粒。

1.3.2 抗氧化性的測(cè)定

1.3.2.1 亞鐵還原能力的測(cè)定

采用Oyaizu等[14]的方法。取0.5 mL的樣品，加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃水浴20 min，加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液2.5 mL在3 000×g條件下離心10 min。取2.5 mL的上層清液與2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1 g/100 mL的三氯化鐵溶液混勻，反應(yīng)10 min后，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。

1.3.2.2 ABTS+·清除能力的測(cè)定

采用Ozgen等[15]的方法。ABTS+·工作液的制備：將7 mmol/L ABTS+·儲(chǔ)備液與140 mmol/L過硫酸鉀（終濃度）混勻。在室溫避光條件下放置12～16 h。使用前用20 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.4）稀釋至在734 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.70±0.01。

取3 mL稀釋的ABTS+·工作液與100 ?L樣品混勻，室溫避光反應(yīng)6 min在734 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

1.3.3.2 分子排阻色譜測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布

采用吳偉等[18]的方法并作適當(dāng)修改，將樣品稀釋到質(zhì)量濃度1 mg/mL，并過孔徑為0.22 μm的濾膜，收集濾液用于相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定。使用了Agilent高效液相系統(tǒng)和選擇TSK G2000SW柱以及Agilent紫外檢測(cè)器。流動(dòng)相為50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，流速1 mL/min，壓強(qiáng)為0.3 MPa，測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為25 ℃。標(biāo)準(zhǔn)蛋白用Marker（分子質(zhì)量為6 500～200 000 kD）進(jìn)行校正，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1分析軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血漿蛋白水解物的抗氧化能力

2.1.1 豬血漿蛋白水解物的還原能力

由圖1可知，與未水解的豬血漿蛋白相比，3 種蛋白酶水解后的豬血漿蛋白還原能力明顯增加（P<0.05）。這是由于水解使肽鍵斷裂增加了氫離子（質(zhì)子和電子）的可利用性，使水解物獲得較強(qiáng)的還原能力[19]。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解物的還原能力都表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。同時(shí)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原能力要顯著高于其他處理組（P<0.05），80 min時(shí)酶解產(chǎn)物的還原能力高達(dá)0.297。這是由于堿性蛋白酶作為一種內(nèi)肽酶主要切割多肽鏈內(nèi)部的肽鍵，從而產(chǎn)生具有抗氧化活性的小肽或多肽。研究結(jié)果與馬艷芳等[20]研究的螺旋藻水解物的還原能力與水解時(shí)間的關(guān)系的變化趨勢(shì)相一致，即還原能力隨著水解時(shí)間的增加而增大，但達(dá)到最大值后，再提高水解時(shí)間，還原能力反而降低[21]。這說明生產(chǎn)抗氧化性肽時(shí)，應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)原料的種類，控制不同的水解時(shí)間，以獲得最大還原能力。

2.1.2 豬血漿蛋白水解物的清除ABTS+·能力

由圖2可知，堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物ABTS+·清除能力分別為51.7%、53.4%、57.1%、59.1%和53.6%，均顯著高于其他處理組（P<0.05）。已有研究發(fā)現(xiàn)與其他蛋白酶相比，堿性蛋白酶水解后的產(chǎn)物具有更強(qiáng)的自由基清除能力[22-23]。

DPPH自由基可以通過接受電子成為相對(duì)穩(wěn)定的抗磁性分子。酶法水解使豬血漿蛋白的結(jié)構(gòu)破壞產(chǎn)生未折疊的蛋白質(zhì)，暴露的氨基酸殘基的電子供體可以與自由基反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的產(chǎn)品并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

由圖3可知，經(jīng)過3 種蛋白酶水解的豬血漿蛋白與沒有經(jīng)過水解的蛋白相比，DPPH自由基清除能力都有較為明顯的提高（P<0.05），并呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。這是由于水解改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，分解成了多肽或游離的氨基酸，使其具有了一定的抗氧化活性[24]。通過比較各處理組發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解80 min的產(chǎn)物顯示出了相對(duì)高的自由基清除能力?？梢姷鞍酌阜N類及水解時(shí)間能夠在一定程度上影響水解物對(duì)自由基的清除活性[25]。

2.2 不同酶及水解時(shí)間對(duì)豬血漿蛋白水解物乳化性質(zhì)的影響

在乳化體系中，EAI和ESI能夠充分反映蛋白質(zhì)的乳化性能[26]。由表1～2可知，水解后的豬血漿蛋白EAI呈現(xiàn)出先增高后降低的變化趨勢(shì)，這是由于小肽雖然能迅速擴(kuò)散到界面上，但由于電荷斥力的作用可能不容易結(jié)塊產(chǎn)生脂肪球膜，因此不能穩(wěn)定乳狀液，進(jìn)而導(dǎo)致EAI的降低[19]。堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化能力顯著高于其他2 個(gè)處理組（P<0.05）。水解前的加熱處理能夠使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輕微展開，水解所產(chǎn)生的一些大分子物質(zhì)能夠更好地吸附于油-水界面，從而降低油水兩相的界面張力，致使EAI有所提高[27]。而水解肽段含量的增多有助于提高乳狀液的ESI。這與Cheng等[28]研究馬鈴薯蛋白水解物乳化性的結(jié)果具有一致性，即隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，小肽的數(shù)量增多，水解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性越低。與未水解的豬血漿蛋白相比，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解的豬血漿蛋白EAI、ESI卻有所降低，這是可能是因?yàn)榈鞍姿夂蠓肿淤|(zhì)量降低、表面電荷增加，低分子質(zhì)量的肽使乳狀液中的雙親性降低，在一定程度破壞了蛋白的乳化性[29]。因此，對(duì)比3 種蛋白酶水解豬血漿蛋白的乳化性質(zhì)，堿性蛋白酶在水解60 min時(shí)具有相對(duì)較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

2.3 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布

分子排阻色譜根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小來分離不同分子質(zhì)量物質(zhì)的混合物，并依據(jù)樣品洗脫時(shí)間劃分其分離部分的分子質(zhì)量分布。通過分子質(zhì)量排布表可以進(jìn)一步解釋豬血漿蛋白酶解后乳化性質(zhì)和抗氧化活性趨勢(shì)變化的原因。依照保留時(shí)間和峰面積的大小進(jìn)而將樣品圖譜劃分為以下4 個(gè)區(qū)域，分別為：區(qū)域Ⅰ（>50 kD）、區(qū)域Ⅱ（50～10 kD）、區(qū)域Ⅲ（10～5 kD）、區(qū)域Ⅳ（<5 kD）。

由表3可知，對(duì)比水解前后的豬血漿蛋白，大分子蛋白含量總體呈下降趨勢(shì)，小分子蛋白含量顯著增加

（P<0.05），生成的小分子主要是集中在區(qū)域Ⅱ內(nèi)，說明酶解的過程中大分子的蛋白被進(jìn)一步水解成了小肽或氨基酸。其中，堿性蛋白酶酶解的變化趨勢(shì)最為顯著。堿性蛋白酶顯示出大于50 kD的蛋白含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在60 min時(shí)峰面積最大，這說明水解的過程中既有多肽鏈斷裂同時(shí)還發(fā)生蛋白質(zhì)的聚集[30]，大分子肽或者水解肽段的含量多有助于提高乳化穩(wěn)定性[31]，這與堿性蛋白酶酶解后乳化性變化趨勢(shì)一致；小于5 kD和10～5 kD的分子呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，小分子蛋白含量的增多，對(duì)抗氧化性起到主要作用。

3 結(jié) 論

通過對(duì)豬血漿蛋白多肽性質(zhì)的進(jìn)一步研究和分析，結(jié)果顯示，與木瓜蛋白酶和中性蛋白酶相比，堿性蛋白酶能顯著提高豬血漿蛋白水解物的抗氧化活性，并且堿性蛋白酶酶解60 min的產(chǎn)物具有最高的乳化特性。通過分子排阻色譜能夠進(jìn)一步解釋豬血漿蛋白水解物抗氧化能力和乳化活性的變化趨勢(shì)的原因。因此，通過堿性蛋白酶適度酶解可以獲得既具有較高乳化性質(zhì)又具有一定抗氧化能力的豬血漿蛋白水解物。經(jīng)過進(jìn)一步研究，豬血漿蛋白水解物具有作為天然抗氧化劑及用于食品乳化體系中的潛力。

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