于 瑩，陳立志，王紅梅，韓 坤，呂 嬌，馬 帥，白 雪*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130122;3.威海市文登區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心,山東 威海 264400；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

大腸桿菌(Escherichiacoli)本是一種正常的腸道菌群，但當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，可引起多種腸道內(nèi)及腸道外疾病[1]。大腸桿菌引起的疾病在不同國(guó)家及地區(qū)都有發(fā)生，牛、羊感染大腸桿菌可引起腹瀉疾病[2-3]；禽類感染大腸桿菌主要引起禽敗血癥、慢性呼吸道疾病、卵黃感染、大腸桿菌性肉芽腫等疾病[4]；毛皮動(dòng)物感染大腸桿菌可引起流產(chǎn)等疾病[5]。大腸桿菌也是人眼炎的主要病原[6]，人感染大腸桿菌后可引起角膜炎、眼內(nèi)炎及眼窩蜂窩織炎等疾病。鹿大腸桿菌病是對(duì)養(yǎng)鹿業(yè)危害嚴(yán)重的一種病，該病在臨床上可引起鹿消化道感染及敗血癥等癥狀，甚至引起鹿死亡，給養(yǎng)鹿業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。并且隨著抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥率不斷增加，耐藥譜不斷擴(kuò)大，這為臨床治療鹿大腸桿菌病帶來了困難。

近年來，由大腸桿菌導(dǎo)致的鹿源大腸桿菌病的報(bào)道較少，2018年7月，吉林省長(zhǎng)春市張二路鹿場(chǎng)廠發(fā)生多只鹿死亡。我們對(duì)死亡的鹿進(jìn)行剖檢后發(fā)現(xiàn)，其肺部出血嚴(yán)重、肝腫大、質(zhì)地脆弱、脾臟梗死、腸內(nèi)容物充實(shí)呈褐色、腸黏膜有黑色出血點(diǎn)，經(jīng)肝臟、肺臟涂布有單一病原菌。經(jīng)16SrRNA測(cè)序鑒定為大腸桿菌，再此基礎(chǔ)上，還完成了生物特性分析及藥敏試驗(yàn)，為獸醫(yī)臨床治療鹿大腸桿菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物病料樣品采集自瀕死期患病鹿肝臟、肺臟組織。體質(zhì)量為(20±22) g的6周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑蛋白胨、酵母粉、MH培養(yǎng)基、臨床常用的抗生素藥敏片均購(gòu)自O(shè)XOID公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；腸菌科生化鑒定管購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及引物分別購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及生化鑒定挑取死亡病鹿肝臟和肺臟病料劃線接種于PYG平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落接種于5 mL PYG液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。并按照腸菌科生化鑒定試劑盒說明書將分離純化后菌株接種于半固體瓊脂、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶等16種生化試劑中，37℃溫箱培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.4 分離株分子生物學(xué)鑒定通過煮沸法獲取分離株基因組DNA。將純化后的分離株接種于PYG平板，劃線培養(yǎng)過夜后，刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150 mL三蒸水中混勻，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，上清液作為PCR模板，-20℃存儲(chǔ)。

選取提取DNA為模板，以 27F/1429R 為引物對(duì) 16SrRNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶10 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s，25個(gè)循環(huán)；72℃，1 min。得到陽(yáng)性產(chǎn)物送入生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，利用 BLAST 程序與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。并利用DNAStar和Mega5.05對(duì)分離菌株與部分大腸桿菌的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 血清型鑒定根據(jù)大腸桿菌菌屬診斷試劑盒說明書，采用玻片凝集法，于潔凈載玻片上滴加10 μL O型因子診斷血清，取適量菌落與血清混合，輕輕晃動(dòng)玻片，1 min中內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集為陽(yáng)性，呈均勻混濁為陰性，陰性以無菌生理鹽水作為對(duì)照。

1.6 人工感染小鼠試驗(yàn)挑取單菌落于5 mL PYG液體培養(yǎng)基中37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將18～22 g 雌鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，分別腹腔注射1.04×107，1.04×106，1.04×105CFU等3個(gè)濃度菌液，0.2 mL/只。小鼠觀察期7 d，記錄每天死亡只數(shù)，采用Reed-Muench法計(jì)算LD50。

1.7 運(yùn)動(dòng)性測(cè)定挑取分離株菌落點(diǎn)中于LB半固體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、酵母5 g、NaCl 10 g及瓊脂粉4 g溶于1 L蒸餾水中)上，于37℃培養(yǎng)12 h后，測(cè)量分離株運(yùn)動(dòng)圈的大小。

1.8 生物膜生成能力測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[7]并進(jìn)行改進(jìn)，方法如下：將分離株于PYG液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，將而培養(yǎng)好的菌液與培養(yǎng)基進(jìn)行1∶200稀釋，吸取200 μL稀釋好的菌液到96孔平板中，每株做4個(gè)重復(fù)以及1個(gè)空白培養(yǎng)基的對(duì)照組，蓋上蓋子，37℃培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基后，用無菌PBS溶液漂洗3遍。之后加入200 μL甲醇溶液，固定15 min，棄去甲醇溶液，室溫下自然晾干。再加200 μL的結(jié)晶紫溶液，染色5 min，倒掉結(jié)晶紫，用自來水沖洗，直至洗凈多余染液。此時(shí)在孔壁上可看見紫色環(huán)狀生物膜，干燥若干小時(shí)，加入160 μL的33%冰醋酸，溶解生物膜，靜置10 min，移液槍吹打幾次后，轉(zhuǎn)移到新96孔板中。讀取570 nm出的D值。生物被膜形成標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)D≤Dc時(shí)，結(jié)果為無(—)；當(dāng)Dc

1.9 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)所述的K-B紙片法進(jìn)行，選取22種常用抗生素。用濁度儀將過夜培養(yǎng)的菌液濁度調(diào)至0.5，之后均勻涂布于MH瓊脂平板，靜置后用無菌鑷子取藥敏片貼于平板表面，37℃培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及生化鑒定分離株接種于PYG固體培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，生長(zhǎng)出邊緣整齊，表面光滑的白色菌落。挑取純化后菌落，經(jīng)革蘭染色，鏡檢可發(fā)現(xiàn)大量?jī)啥蒜g圓的粉紅色革蘭陰性短桿菌(圖1)。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)硫化氫、尿素酶、肌醇、核糖醇、MR-VP顯陰性(表1)。此生化特性與大腸桿菌相似。

圖1 革蘭染色后的細(xì)菌形態(tài)

2.2 分離株分子生物學(xué)鑒定采用PCR方法擴(kuò)增分離株16SrRNA基因片段，獲得1 500 bp左右基因片段進(jìn)行測(cè)序(圖2)，結(jié)果顯示該分離株與GenBank中登錄的大腸桿菌多個(gè)參考株的同源性均為99%。經(jīng)16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，進(jìn)化樹分為2個(gè)大分支，分離株Ed-102與其余7株大腸桿菌均不在同一分支上，但具有同一進(jìn)化來源(圖3)。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1.菌株Ed-102；2.陰性對(duì)照

圖3 基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 血清型鑒定結(jié)果血清型鑒定結(jié)果表明，分離株Ed-102與大腸桿菌O102型血清出現(xiàn)凝集，生理鹽水對(duì)照不凝集。因此鑒定分離株為O102型大腸桿菌。

2.4 人工感染小鼠試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠攻讀12 h后，開始死亡。發(fā)病小鼠主要癥狀為精神沉郁，被毛雜亂，眼睛有明顯分泌物。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝、肺及脾部有不同程度出血點(diǎn)，腸內(nèi)容物充實(shí)。無菌采集小鼠肝、肺部接種于PYG固體培養(yǎng)基，18 h后獲得單一病原菌，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)此分離株與Ed-102形態(tài)一致。采用Reed-Muench法計(jì)算小鼠LD50為1.20×107CFU/只，對(duì)照組小鼠健康無異常(表2)。

2.5 運(yùn)動(dòng)性測(cè)定分離株經(jīng)LB半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后，發(fā)現(xiàn)分離株在LB半固體培養(yǎng)基上可形成運(yùn)動(dòng)圈，直徑大小為8.63 mm。

2.6 生物膜生成能力測(cè)定生物被摸能力測(cè)定結(jié)果表示，分離株Ed-102生物膜形成能力較弱(表3)。

表2 分離菌株Ed-102的LD50

表3 生物被膜檢測(cè)結(jié)果

2.7 藥敏試驗(yàn)藥敏結(jié)果顯示，分離株Ed-102對(duì)氨芐西林、哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、西諾沙星、萘啶酸及氯霉素耐藥，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、妥布霉素中度耐藥，僅對(duì)于阿米卡星及亞胺培南較為敏感(表4)。

表4 分離株的藥敏試驗(yàn)

3 討論

近幾年，隨著養(yǎng)鹿業(yè)的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度的不斷增加，細(xì)菌性疾病對(duì)養(yǎng)鹿業(yè)的影響也越來越大。然而，對(duì)于大腸桿菌引起的鹿腹瀉及敗血癥疾病的研究卻很少。本試驗(yàn)為探究鹿源大腸桿菌的生物特性、致病力及耐藥情況，對(duì)分離株的運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、毒力以及耐藥性進(jìn)行了測(cè)定，為獸醫(yī)臨床治療鹿大腸桿菌病提供理論依據(jù)。

研究表明，分離株Ed-102在顯微鏡下為兩端鈍圓的粉紅色革蘭陰性短桿菌，生化試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)硫化氫、尿素酶、肌醇、核糖醇、MR-VP顯陰性，此生化特性與大腸桿菌相似，進(jìn)一步證明該分離株為大腸桿菌。經(jīng)16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明分離株與7株大腸桿菌并不在一個(gè)分支上，但具有共同來源，這可能是菌株的宿主和地域的差異性所決定的，具體原因還需要進(jìn)一步探討。經(jīng)玻板凝集試驗(yàn)表明，分離株為O102型大腸桿菌。研究表明，不同的血清型的大腸桿菌在一定條件下可引起人和動(dòng)物感染不同疾病。其中O1、O2、O18和 O78型大腸桿菌是禽類患病的主要優(yōu)勢(shì)血清型[8]，O2、O8、O138、O139及O141型大腸桿菌為豬患病主要優(yōu)勢(shì)血清型[9]。而O102型大腸桿菌作為鹿源致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型未曾報(bào)道過，說明O102可能作為鹿源致病性大腸桿菌的主要致病性血清型。

從分離株的運(yùn)動(dòng)特征可以發(fā)現(xiàn)，分離株Ed-102可在LB半固體培養(yǎng)基上形成直徑為8.63 mm的運(yùn)動(dòng)圈，說明此分離株有運(yùn)動(dòng)性。生物膜是細(xì)菌在不利條件下存活所形成的特殊結(jié)構(gòu)[10]。有研究表明，生物膜可以顯著增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗能力且使慢性感染宿主疾病難以治愈的主要原因之一[11-12]。通過生物被膜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離株的生物膜形成能力較弱，這可能與鹿源大腸桿菌為急性感染有關(guān)。人工感染小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株Ed-102能引起小鼠后肝臟、肺臟不同程度的出血，其對(duì)小鼠的LD50達(dá)1.20×107CFU/只，說明此分離株致病力強(qiáng)，應(yīng)引起足夠的重視。

目前，由于抗生素在臨床上的大量使用，加上使用不規(guī)范及使用方法不當(dāng)，使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)[13]。本試驗(yàn)選取22種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離株Ed-102對(duì)17種抗生素高度耐藥，分別為氨芐西林、哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、西諾沙星、萘啶酸及氯霉素，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、妥布霉素中度耐藥，僅對(duì)于阿米卡星及亞胺培南較為敏感。這與薛原等[13]對(duì)150株鹿源大腸桿菌耐藥性測(cè)定結(jié)果相似，其測(cè)定的對(duì)對(duì)氨芐西林、四環(huán)素的高耐藥率與對(duì)亞胺培南高敏感率與本試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議養(yǎng)殖戶使用阿米卡星治療患病鹿，并取得了良好的效果。綜合來看，分離株Ed-102具有高耐藥性，建議養(yǎng)殖戶通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物治療患病鹿，不要盲目使用抗生素，以免造成耐藥，耽誤病情。同時(shí)建議養(yǎng)殖戶將病畜與健康動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并且搞好環(huán)境衛(wèi)生，不要飼喂污染的飼料和水源。