婁 飛，張 勇，王建鋒，鄧旭明*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物醫(yī)藥學院，鄭州 河南 450046)

沙門菌為一種重要的人獸共患病源菌，在世界范圍內(nèi)已出現(xiàn)了多種耐藥性菌株[1-4]，直接威脅著人類公共及食品安全[5-7]。沙門菌主要通過食源性傳播的形式感染人類及動物，引起一些相關(guān)的胃腸道疾病，嚴重者可導致系統(tǒng)性感染?？股氐氖褂谜T導細菌耐藥性的產(chǎn)生。因此，目前迫切需要一種新的抗感染策略去解決日益嚴重的耐藥性問題。

沙門菌主要擁有2套毒力系統(tǒng)SPI1和SPI2[8-9]。毒力島1在沙門菌入侵宿主細胞的過程中，發(fā)揮著重要的作用[10-12]。毒力島2在沙門菌寄居宿主細胞的過程中，發(fā)揮著重要的作用[14-16]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)在革蘭陰性細菌中保守存在，并且在細菌感染宿主的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17-18]。由于T3SS并不是細菌生長所必需基因[19-20]，通過抑制T3SS的功能，在不影響細菌生長的情況下，通過機體免疫防御系統(tǒng)將細菌從體內(nèi)清除。所以，在沙門菌感染的過程中，以T3SS為藥物靶標，能夠達到抗沙門菌感染目的。

目前，已有相關(guān)文獻報道多種小分子能夠抗沙門菌感染，以T3SS為藥物靶標，達到抗沙門菌的報道較少。肉桂油口服液作為臨床常用藥，成本較低，易于提取，且藥理活性多樣。目前，肉桂油口服液抗沙門菌感染的體內(nèi)藥理活性分析未見報道。

1 材料與方法

1.1 藥物、細菌及試驗動物肉桂油口服液(含肉桂油以桂皮醛計，每1 mL不低于100 mg，由本實驗室制備)；藥物溶劑，不含肉桂油的輔料溶劑；雌性BALB/c小鼠(6～8周齡)購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司；鼠傷寒沙門菌SL1344由普渡大學羅招慶教授饋贈。

1.2 肉桂油口服液制備及含量測定取檸檬酸0.3 g，用少量水溶解后，用丙二醇150 mL，磁力攪拌至完全溶解后，依次加入肉桂油120 g、聚山梨酯-80為20 g、PEG400為650 mL，攪拌完全后，加入純凈水至總體積1 000 mL，5%檸檬酸控制溶液pH值在5.0～7.0范圍內(nèi)，過濾，灌裝即得。

使用HPLC液相色譜儀，以對照品為參照，測定肉桂油口服液在液相色譜儀中的峰面積，按照外標法計算峰面積，即得。

1.3 測定沙門菌半數(shù)致死量挑取單克隆沙門菌至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，過夜培養(yǎng)，次日1∶20擴大培養(yǎng)至對數(shù)期后，經(jīng)口灌服感染小鼠。將50只BALB/c雌性小鼠，平均分為5組，分別為PBS組和不同感染菌量組(1×106，5×106，1×107，5×107CFU/只)。10 d觀察期內(nèi)，每天記錄小鼠的死亡率。

1.4 小鼠感染沙門菌后的治療劑量的確定按照方法1.3中確定的半數(shù)致死劑量，將30只BALB/c雌性小鼠平均分為3組，分別灌服給予高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3個治療劑量的肉桂油口服液，8 h/次，在10日觀察期內(nèi)記錄不同治療組小鼠的死亡率。

1.5 死亡率統(tǒng)計分析將40只BALB/c雌性小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為健康對照組、沙門菌感染組、沙門菌感染+藥物溶劑組(藥物溶劑與沙門菌混懸液)、沙門菌感染+肉桂油口服液組。試驗前，使用含鏈霉素飲用水預處理小鼠3 d，不同感染組(沙門菌感染組、沙門菌感染+溶劑組、沙門菌感染+肉桂油口服液組)，每只小鼠口服給予5×106CFU 的菌量。每只小鼠感染5×106CFU的細菌量。沙門菌感染+溶劑組和沙門菌感染+肉桂油口服液組，感染前1 d分別給予溶劑和肉桂油口服液，每次藥物給予時間間隔為8 h，藥物劑量為每次100 mg/kg。10日觀察其內(nèi)，每天記錄小鼠死亡數(shù)量。

1.6 體質(zhì)量指標的監(jiān)測按照1.5的試驗分組及給藥方案，細菌感染劑量調(diào)整為106CFU/只，在10 d 治療期間內(nèi)每天稱量每只小鼠的體質(zhì)量，分析小鼠的體質(zhì)量變化情況。

1.7 盲腸組織病理學分析及炎癥細胞因子測定按照1.5的試驗方法。感染后5 d處死小鼠，剪取部分盲腸組織，使用PBS沖洗干凈后，將其浸泡于4%甲醛中固定組織，經(jīng)脫水、透化、包埋、切片及HE染色并晾干后，顯微鏡下觀察不同處理組盲腸的組織病理學變化。將剩余的盲腸組織研磨后制備10%組織勻漿液，5 000 r/min離心5 min。ELISA法檢測上清中IL1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理組間差異顯著性分析使用SPSS 19.0軟件。*表示差異顯著用，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 肉桂油口服液含量肉桂油口服液含量測定對照品及樣品色譜圖如圖1，2所示，經(jīng)檢測肉桂油口服液中桂皮醛的含量為100.02 g/L。

2.2 沙門菌感染小鼠攻菌量和肉桂油口服液治療劑量的確定

2.2.1沙門菌感染小鼠攻菌量的確定 結(jié)果圖3所示。不同感染劑量(5×106，1×107，5×107CFU/只)灌胃小鼠后，小鼠在10日觀察期內(nèi)全部死亡；1×107CFU/只感染組小鼠在感染后7 d、5×107CFU/只感染組小鼠在感染后4 d全部死亡，5×106CFU/只的感染組小鼠在感染后9 d全部死亡；1×106CFU/只的感染劑量并不導致小鼠死亡(10日觀察期內(nèi))，因此本試驗選用5×106CFU/只的感染劑量用于致死率統(tǒng)計分析，選用1×106CFU/只的感染劑量用于其他試驗目的的統(tǒng)計分析(圖3)。

圖1 肉桂油口服液對照品HPLC色譜圖

圖2 肉桂油口服液樣品HPLC色譜圖

圖3 沙門菌的感染劑量對小鼠死亡率的影響 1. PBS組，小鼠給予PBS；2. 1×106組，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；3. 5×106組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；4. 1×107組，以1×107 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；5. 5×107組，以5×107 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠

2.2.2肉桂油口服液治療劑量的確定 基于2.2.1的結(jié)果，以5×106CFU/只感染菌量灌胃感染小鼠并同時分別給予高劑量(200 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)和低劑量(50 mg/kg)肉桂油口服液，在10日觀察期內(nèi)，低劑量組(50 mg/kg)對不能顯著降低感染小鼠死亡率(P>0.05)，中劑量(100 mg/kg)和高劑量(200 mg/kg)均可顯著降低感染小鼠的死亡率，與中劑量(100 mg/kg)組相比，高劑量(200 mg/kg)組對小鼠死亡率的影響并無顯著性的提升，因此本試驗選用中劑量(100 mg/kg)進行后續(xù)試驗(圖4)。

2.3 肉桂油口服液降低沙門菌感染小鼠的死亡率如圖5所示，與溶劑對照組和無藥物處理對照組相比，100 mg/kg肉桂油口服液治療后可顯著降低鼠傷寒沙門菌SL1344感染小鼠死亡率，表明肉桂油口服液可降低沙門菌感染小鼠死亡率。

2.4 肉桂油口服液逆轉(zhuǎn)沙門菌感染小鼠體質(zhì)量下降的趨勢如圖6所示，鼠傷寒沙門菌感染組和鼠傷寒沙門菌+溶劑組小鼠體質(zhì)量一直處于下降趨勢，經(jīng)肉桂油口服液治療后，隨著藥物治療時間的延長，感染小鼠的體質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，表明肉桂油口服液治療可逆轉(zhuǎn)沙門菌感染小鼠體質(zhì)量下降的趨勢。

2.5 肉桂油口服液緩解沙門菌感染小鼠盲腸病理性損傷組織病理學檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染組和感染+溶劑組小鼠盲腸上皮細胞層出現(xiàn)嚴重潰瘍現(xiàn)象，腸壁和黏膜下層間隙增寬，大量的炎性細胞浸潤于間隙中間。但感染小鼠經(jīng)肉桂油口服液治療后，小鼠盲腸組織病理變化并不明顯，與空白組小鼠盲腸病理組織形態(tài)相似(圖7)。

2.6 肉桂油口服液緩解沙門菌感染小鼠盲腸的炎性反應如圖8所示，鼠傷寒沙門菌感染+肉桂油口服液組小鼠盲腸細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)的含量極顯著地低于細菌感染組和細菌感染+藥物溶劑組，表明肉桂油口服液能夠顯著降低沙門菌感染小鼠盲腸炎癥因子含量，可有效緩解沙門菌感染小鼠盲腸的炎性反應。

圖4 不同劑量肉桂油口服液對沙門菌感染小鼠死亡率的影響 1. 僅感染組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；2.50 mg/kg組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予 50 mg/kg肉桂油口服液； 3. 100 mg/kg組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予100 mg/kg肉桂油口服液；4. 200 mg/kg組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予200 mg/kg肉桂油口服液

圖5 肉桂油口服液(100 mg/kg)對沙門菌感染小鼠死亡率的降低作用 1.健康對照組，小鼠無細菌感染；2.細菌感染組+肉桂油口服液，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予100 mg/kg肉桂油口服液；3.細菌感染組，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；4.細菌感染組+藥物溶劑，以5×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予藥物溶劑

圖6 肉桂油口服液(100mg/kg)逆轉(zhuǎn)沙門菌感染小鼠體質(zhì)量下降 1.健康對照組，小鼠無細菌感染；2.細菌感染組+肉桂油口服液，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予100 mg/kg肉桂油口服液；3.細菌感染組，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；4.細菌感染組+藥物溶劑，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予藥物溶劑

圖7 肉桂油口服液緩解沙門菌感染小鼠盲腸組織病理性損傷 1.健康對照組，小鼠無細菌感染；2.細菌感染組+肉桂油口服液，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予100 mg/kg肉桂油口服液；3.細菌感染組，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠；4.細菌感染組+藥物溶劑，以1×106 CFU細菌/只攻菌量感染小鼠，同時給予藥物溶劑

3 討論

傳統(tǒng)的抗生素往往以細菌必需成分為藥物靶標，容易引起細菌耐藥性的產(chǎn)生[21]。目前，已有多篇文獻報道抗沙門菌感染的抑制劑[22-24]，但多數(shù)原材料的不易獲得，價格昂貴，藥理機制不夠清晰，限制了小分子抑制劑的應用。天然化合物能夠有效規(guī)避原材料的難獲取及價格高昂等不利因素。本試驗結(jié)果表明，抗沙門菌感染的抑制劑肉桂油[25]能夠以T3SS為藥物靶標，通過抑制T3SS的功能達到抗沙門菌感染的作用，且不影響細菌生長，規(guī)避了細菌耐藥性的產(chǎn)生。動物試驗結(jié)果表明，肉桂油口服液能夠顯著的降低感染小鼠的死亡率，緩解沙門菌感染小鼠引起的體質(zhì)量下降。病理學試驗表明，肉桂油口服液顯著緩解了沙門菌感染小鼠的盲腸組織病理性損傷并且抑制盲腸炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)的釋放。以上結(jié)果提示，肉桂油口服液是一種潛在的抗沙門菌感染抑制劑。

圖8 肉桂油口服液降低沙門菌感染小鼠盲腸細胞因子含量

目前的研究表明抗生素的使用，對細菌的選擇性壓力較大，易誘導細菌耐藥性的產(chǎn)生，以沙門菌生長非必需基因T3SS為藥物靶標，對細菌選擇壓力小，不易誘導細菌耐藥性的產(chǎn)生，可以減少或者部分替代抗生素的使用，增加細菌耐藥性的周期，延長抗生素的使用周期。