王 涵，岳巧嫻，許利軍，周榮艷*，陳 燁，陳 輝，張振紅

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北 保定 071001)

蛋雞在產(chǎn)蛋期存在獨(dú)特的骨代謝過(guò)程，骨吸收時(shí)髓質(zhì)骨被破骨細(xì)胞黏附并分解釋放蛋殼形成所需要的鈣[1]；骨形成時(shí)髓質(zhì)骨吸收多余的鈣，被成骨細(xì)胞重建[2]。骨代謝過(guò)程中，成骨細(xì)胞是主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，參與骨的形成和重建[3]；骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)為髓質(zhì)骨的主要組成成分，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞對(duì)髓質(zhì)骨的黏附，在骨代謝中起重要作用[4-7]。當(dāng)外源鈣長(zhǎng)期供應(yīng)不足時(shí)，骨代謝平衡被打破，髓質(zhì)骨被過(guò)度吸收，引發(fā)蛋雞骨質(zhì)疏松癥，造成骨折和癱瘓，降低產(chǎn)蛋性能和經(jīng)濟(jì)效益。

褪黑素是由脊椎動(dòng)物腦部松果體合成分泌的一類吲哚類激素，在機(jī)體的代謝方面發(fā)揮著重要的生理學(xué)效應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn),蛋雞產(chǎn)蛋率與血液中褪黑素水平呈正相關(guān)[9]，在飼料中補(bǔ)充褪黑素可增加蛋重并提高蛋雞脛骨和股骨斷裂強(qiáng)度[10]，提升蛋雞生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益，但褪黑素提高蛋雞骨骼質(zhì)量的具體機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能與成骨細(xì)胞分化、增殖和BSP表達(dá)水平相關(guān)。本試驗(yàn)通過(guò)體外分離培養(yǎng)原代雞成骨細(xì)胞，研究褪黑素對(duì)雞成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，為褪黑素調(diào)節(jié)蛋雞骨代謝和產(chǎn)蛋性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物15胚齡雞胚(種蛋)10只，不計(jì)大小，不分雌雄。試驗(yàn)過(guò)程符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要試劑0.25% Trypsin-EDTA(Gibco,US)、青鏈霉素(Gibco,US)、胎牛血清(Gibco,US)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco,US)、PBS緩沖液(Gibco,US)、褪黑素(Sigma,US)、Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁，日本)、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液(索萊寶，北京)、茜素紅染色液(索萊寶，北京)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，上海)、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(碧云天，上海)。

1.3 成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純化用酒精浸泡消毒15胚齡雞胚，再用PBS緩沖液清洗以去除殘留酒精；剪開(kāi)頭部皮膚，取出顱骨，刮去骨膜及骨縫間結(jié)締組織，剪成約1 mm×1 mm大小的骨片，并用PBS緩沖液清洗；加入2 mL 0.25% Trypsin-EDTA(1×)進(jìn)行消化處理(37℃，10 min)后，加入2 mL培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1%青鏈霉素)終止消化；將碎骨片均勻鋪于6孔板中，每孔6～7塊，翻轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2，飽和濕度)，使骨片貼壁；3 h后轉(zhuǎn)正6孔板，加入2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)；每3天更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(約21 d)后傳代培養(yǎng)，采用差速貼壁法純化細(xì)胞。

1.4 成骨細(xì)胞的鑒定

1.4.1成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)成骨細(xì)胞形態(tài)，以了解其生長(zhǎng)狀況。

1.4.2成骨細(xì)胞染色鑒定 將純化后的F2代細(xì)胞以6×104個(gè)/孔接種到6孔板中，每3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞均勻分布、融合度為80%～90%時(shí)染色。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5% Triton X-100通透處理。

姬姆薩染色：加入瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液染色2 h；棄染色液，PBS洗3次，在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

甲苯胺藍(lán)染色：加入0.5%甲苯胺藍(lán)溶液染色30 min；棄染色液，PBS洗1次；加入0.5%冰乙酸分化1 min；棄分化液，PBS洗3次，在普通相機(jī)和倒置相差顯微鏡下拍照并觀察。

堿性磷酸酶(ALP)染色：使用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(進(jìn)行ALP染色。按照商家提供的說(shuō)明書(shū)配制BCIP/NBT染色工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入BCIP/NBT染色工作液室溫避光孵育2 h；棄染色液，PBS洗3次，在普通相機(jī)和倒置相差顯微鏡下拍照并觀察。

茜素紅染色：加入0.2%茜素紅染色液染色2 h；棄染色液，PBS洗3次，在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.5 褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞分化和增殖的影響

1.5.1褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 將純化后的F3代細(xì)胞以3 000個(gè)/孔接種于96孔板，并添加0，10，50，100 μmol/L褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)。用CCK-8試劑盒，從第1天開(kāi)始，每2天更換培養(yǎng)液并進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)測(cè)7次，每次每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，以時(shí)間為橫軸，D值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5.2褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響 將純化后的F4代細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種到24孔板中，24 h 后更換添加10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 mg/L 維生素C的細(xì)胞培養(yǎng)液，再過(guò)24 h后添加0,10,50,100 μmol/L褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，每天每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別培養(yǎng)1,3,7,14 d后，裂解細(xì)胞，使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。

1.5.3褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞BSP基因表達(dá)的影響 將純化后的F4代細(xì)胞以6×104個(gè)/孔接種到6孔板中，24 h后更換添加10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 mg/L維生素C的細(xì)胞培養(yǎng)液，再過(guò)24 h后添加0，10，50，100 μmol/L褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)14 d后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。

以NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)雞的BSPmRNA序列(登錄號(hào)：NM_205162.1)作為參考序列，用在線軟件Primer3設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物設(shè)計(jì)和合成由寶生物工程有限公司完成。正向引物序列為：5′-GGGCGATGAGGACAGTGAT-3′；反向引物序列為：5′-ATGGGGTGTGTGTGCTGTG-3′。選取18S 基因作為內(nèi)參基因，其正向引物序列為：5′-CGAAAGCATTTGCCAAGAAT-3′；反向引物序列為：5′-GGCATCGTTTATGGTCGG-3′。

熒光定量PCR體系總體積為25 μL：12.5 μL Evagreen?qPCR Master Mix,1 μL正向引物(10 μmol/L),1 μL反向引物(10 μmol/L),2 μL cDNA，3.75 μL ROX，加入RNase-Free water補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性5 s，60℃變性30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。折線圖、柱狀圖由GraphPad Prism5軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征顱骨骨片貼壁后2～21 d(圖1A,B,C)，細(xì)胞爬出的數(shù)量逐漸增加，直至鋪滿底部。第2天和第10天的細(xì)胞大多呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，第21天的細(xì)胞因過(guò)于密集，看不出細(xì)胞形態(tài)。純化后的子代細(xì)胞(圖1D,E)也呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，與MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)(圖1F)相似，有成骨細(xì)胞的典型特征。

圖1 原代和子代成骨細(xì)胞(標(biāo)尺為2 μm) A.顱骨骨片貼壁后第2天，已有少數(shù)細(xì)胞爬出;B.顱骨骨片貼壁后第10天，爬出細(xì)胞數(shù)增多;C.顱骨骨片貼壁后第21天，爬出細(xì)胞鋪滿底部，細(xì)胞數(shù)過(guò)多，以至于看不出細(xì)胞形態(tài);D.純化后F1代細(xì)胞第3天;E.純化后F2代細(xì)胞第3天;F.MC3T3-E1細(xì)胞第3天

2.2 姬姆薩染色F2代細(xì)胞姬姆薩染色后，細(xì)胞質(zhì)染成淺紫紅色，細(xì)胞核染成紫紅色(圖2)。細(xì)胞形態(tài)更清晰，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，具有成骨細(xì)胞特征(圖2)。細(xì)胞核呈現(xiàn)不明顯，可能是由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的染色接近造成。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色F2代細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果(圖3A，C)與MC3T3-E1(圖3B，D)一致。6孔板有藍(lán)色沉淀(圖3C)，細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，區(qū)分明顯(圖3A)。細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形(圖3A)，具有成骨細(xì)胞特征。

2.4 堿性磷酸酶(ALP)染色F2代細(xì)胞的6孔板中有紫黑色沉淀(圖4C)；倒置相差顯微鏡下，F(xiàn)2代細(xì)胞中存在黑色沉淀(圖4A)，這與MC3T3-E1(圖4B，D)一致。

圖2 姬姆薩染色的F2代細(xì)胞形態(tài)特征圖

圖3 F2代細(xì)胞、MC3T3-E1甲苯胺藍(lán)染色(標(biāo)尺為1 μm) A,C.F2代細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色;B,D.MC3T3-E1甲苯胺藍(lán)染色

圖4 F2代細(xì)胞、MC3T3-E1 ALP染色(標(biāo)尺為2 μm) A,C.F2代細(xì)胞ALP染色;B,D.MC3T3-E1ALP染色

2.5 茜素紅染色F2代細(xì)胞(圖5A)存在礦化結(jié)節(jié)(箭頭所指)，被染成深紅色，與MC3T3-E1(圖5B)一致。

圖5 F2代細(xì)胞、MC3T3-E1茜素紅染色(標(biāo)尺為2 μm) A,F2代細(xì)胞茜素紅染色;B.MC3T3-E1茜素紅染色

2.6 褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響在圖6中，0 μmol/L 褪黑素處理組的曲線即為成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)F3代成骨細(xì)胞在第1～5天生長(zhǎng)緩慢，第5天生長(zhǎng)加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第11天進(jìn)入平臺(tái)期；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同濃度褪黑素處理(0,10,50,100 μmol/L)的細(xì)胞均在在第11天進(jìn)入增殖平臺(tái)期，不同濃度褪黑素處理間細(xì)胞的增殖差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同濃度褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

2.7 褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響由圖7可知，ALP活性在第3天有所降低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，ALP的活性逐漸升高。由圖8可知，第1天，10 μmol/L 組和50 μmol/L組ALP活性顯著(P<0.05)高于0 μmol/L組和100 μmol/L 組的ALP活性極顯著(P<0.01)高于0 μmol/L組；第3天，10 μmol/L 組的ALP活性顯著(P<0.05)高于0 μmol/L 組；第7天，10 μmol/L組的ALP活性顯著(P<0.05)高于100 μmol/L組；第14天，100 μmol/L 組的ALP活性極顯著(P<0.01)高于0 μmol/L組。

圖7 雞成骨細(xì)胞ALP活性變化圖

2.8 褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞BSP基因表達(dá)的影響數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，漸進(jìn)顯著性水平P=0.09。結(jié)果見(jiàn)圖9，隨著褪黑素濃度的增加，BSP基因的相對(duì)表達(dá)量升高；100 μmol/L組的BSP基因相對(duì)表達(dá)量最高，0 μmol/L組的相對(duì)表達(dá)量最低。

3 討論

成骨細(xì)胞主要由骨髓基質(zhì)中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，是骨代謝過(guò)程中重要的功能細(xì)胞，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過(guò)程，其體外培養(yǎng)是研究骨代謝的重要部分。目前，研究鼠和兔成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定的文章較多[11-12]，僅江莎等[13]對(duì)酶消化法、組織塊貼壁法和誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞法3種雞成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較，成功從15胚齡雞胚顱骨、18胚齡雞胚脛骨和1月齡青年雞脛骨中分離培養(yǎng)得到雞成骨細(xì)胞。本試驗(yàn)采用組織塊貼壁法，成功從15胚齡雞胚顱骨中分離得到成骨細(xì)胞。

圖8 不同培養(yǎng)時(shí)間、不同褪黑素濃度處理的成骨細(xì)胞ALP活性變化

圖9 不同褪黑素濃度處理14 d成骨細(xì)胞BSP基因表達(dá)變化

成骨細(xì)胞一般通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)特征和甲苯胺藍(lán)、堿性磷酸酶和茜素紅等染色鑒定。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，參與骨骼鈣化，常被作為成骨細(xì)胞活性的生物標(biāo)志物，其染色強(qiáng)陽(yáng)性是成骨細(xì)胞的重要特征之一[14-16]。礦化能力是成骨細(xì)胞的一項(xiàng)重要生物學(xué)特征，主要通過(guò)茜素紅染色檢測(cè)。通過(guò)相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞和純化后的子代細(xì)胞均呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，具有成骨細(xì)胞的典型特征。姬姆薩染色使細(xì)胞形態(tài)更加清晰，明確了雞成骨細(xì)胞的細(xì)胞特征。堿性磷酸酶和茜素紅染色表明分離所得的細(xì)胞能生成堿性磷酸酶，且有良好的礦化功能，證實(shí)了該細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞功能。甲苯胺藍(lán)使細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，并且產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，與MC3T3-E1染色結(jié)果一致，證實(shí)了分離所得細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)雞成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制發(fā)現(xiàn)，雞成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分為3個(gè)階段，第1～5天為緩慢生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)緩慢；第5天生長(zhǎng)加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第11天進(jìn)入平臺(tái)期。這表明分離所得雞成骨細(xì)胞具有良好的生殖能力。大鼠和兔分離的成骨細(xì)胞第7天進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期[17-18]，小鼠分離的成骨細(xì)胞增殖第6天達(dá)到高峰[19]，這與我們分離的雞成骨細(xì)胞存在差異，可能是由于物種差異造成的。

使用不同濃度的褪黑素處理成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)0,10,50,100 μmol/L褪黑素處理間細(xì)胞的增殖差異不顯著(P>0.05)，表明褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。ALP活性的高低與成骨細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)，常作為成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物[20]。本試驗(yàn)中，所有褪黑素處理組的ALP活性均先下降，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，表明成骨細(xì)胞的ALP活性存在時(shí)間依賴性，成骨細(xì)胞的分化隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)。在添加褪黑素的第1天和第14天，隨著褪黑素濃度的增加，ALP活性升高，表明褪黑素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，且具有濃度依賴性，當(dāng)褪黑素濃度升高至100 μmol/L時(shí)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。而在第3天和第7天添加褪黑素后，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用減弱，可能是因?yàn)槌晒羌?xì)胞正處在增殖階段，增殖的細(xì)胞越來(lái)越多，分化的細(xì)胞較少。而第1天增殖的細(xì)胞較少，第14天成骨細(xì)胞已經(jīng)處在增殖平臺(tái)期以后，此時(shí)成骨細(xì)胞可能大多數(shù)都進(jìn)行分化，因而褪黑素促進(jìn)其分化的效果顯著。

使用0，10，50，100 μmol/L褪黑素處理培養(yǎng)成骨細(xì)胞14 d，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，BSP基因的相對(duì)表達(dá)量升高，表明褪黑素的添加促進(jìn)了成骨細(xì)胞BSP基因的表達(dá)，且具有濃度依賴性。BSP是成骨細(xì)胞分化的生物標(biāo)志物之一[7]，因而上述結(jié)果也表明了褪黑素的添加促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化，且分化效果隨褪黑素濃度的增加而增強(qiáng)。

本試驗(yàn)通過(guò)組織塊貼壁法從15胚齡雞胚的顱骨中成功分離得到成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞ALP活性先降低，后升高，具有時(shí)間依賴性。褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖無(wú)影響，但提高了成骨細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)了成骨細(xì)胞BSP基因表達(dá)和成骨細(xì)胞分化，且隨濃度增加而作用增強(qiáng)。