周帥帥，關(guān)繼羽，張 競(jìng)，周艷龍，劉 芳，高 宇，趙 魁，高 豐，賀文琦

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

羊傳染性膿皰病在我國(guó)西北、東北等廣大養(yǎng)羊地區(qū)廣泛存在，對(duì)我國(guó)養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，該病俗稱(chēng)“羊口瘡”，是由痘病毒科副痘病毒屬的羊傳染性膿皰病毒(Orf virus ORFV)所引起的一種急性、高度接觸性的人獸共患傳染病。ORFV有較強(qiáng)的嗜上皮性，在病毒感染早期主要是在被感染病畜的口鼻部、外陰部以及母畜的乳房等一些重要部位出現(xiàn)明顯的紅疹、丘疹、水泡等臨床體征和癥狀，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展加劇會(huì)逐漸的形成較大的膿皰甚至?xí)珊窈竦慕Y(jié)痂。羊傳染性膿皰病雖然在成年羊群中造成的病死率較低，但在羔羊中的病死率很高，因?yàn)楦嵫蛟诔匀榈倪^(guò)程中通過(guò)母體而被感染，其主要感染是在口腔及唇舌等部位。由于口腔等處生成了水泡或膿皰造成了羔羊的采食障礙，所以對(duì)羔羊的生長(zhǎng)性能帶來(lái)了嚴(yán)重影響，有時(shí)也會(huì)引起繼發(fā)性細(xì)菌感染會(huì)使病情進(jìn)一步惡化，導(dǎo)致羔羊的死亡[1]。

不同ORFV分離毒株基因組長(zhǎng)度為136～138 kb 不等，約編碼132個(gè)基因。ORFV基因組的中間區(qū)域基因較為保守，多與病毒粒子結(jié)構(gòu)和病毒組裝有關(guān)。兩末端為反向重復(fù)序列，基因結(jié)構(gòu)變異較大，多與病毒的毒力、致病性以及免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。病毒的整個(gè)基因組呈現(xiàn)環(huán)狀并在交匯處存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在掃描電鏡下可見(jiàn)病毒粒子為橢圓形并在其自身表面存在相互交錯(cuò)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2-4]。該病毒在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中完成自身的復(fù)制過(guò)程，并在高爾基體上形成囊膜，最后通過(guò)使宿主細(xì)胞的破裂得以重新釋放。

研究人員已經(jīng)闡明了一些ORFV的毒力基因的致病機(jī)制[5-6]。如ORFV132基因所編碼合成的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，該因子作用于宿主機(jī)體時(shí)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖，這就為病毒復(fù)制提供細(xì)胞底物[7]。ORFV125基因是抗凋亡基因，該基因編碼生成的蛋白與Bcl-2家族中的Bak有著相似的表面結(jié)構(gòu)可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制凋亡的激活，所以該基因的表達(dá)可以防止病毒感染細(xì)胞的凋亡。ORFV117基因編碼的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集結(jié)刺激因子抑制因子可以和IL-2結(jié)合并抑制其生物活性進(jìn)而減弱機(jī)體的免疫應(yīng)答，減緩機(jī)體對(duì)病毒的殺滅作用。ORFV112基因是一種毒力基因，在毒性和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ORFV將CBP分泌到皮膚上皮細(xì)胞中,競(jìng)爭(zhēng)性地抑制趨化因子與同源受體的相互作用,從而抑制趨化性和白細(xì)胞募集[8]。還有ORFV002,ORFV024和ORFV121基因所編碼合成的產(chǎn)物是 NF-kB信號(hào)通路的抑制劑，抑制宿主細(xì)胞中NF-KB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的不同過(guò)程，有助于ORFV逃避宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[9-13]。雖然通過(guò)前人的研究已經(jīng)對(duì)ORFV一些基因功能有所了解，但是依然還有許多基因的功能有待于我們?nèi)グl(fā)掘。如位于末端可變區(qū)的ORFV122基因就是功能未知基因。為了對(duì)ORFV122基因的功能做進(jìn)一步的研究就要做好前期的物質(zhì)準(zhǔn)備。所以在本研究中，我們純化得到了ORFV122蛋白并免疫小鼠得到了多克隆抗體，為后續(xù)的ORFV122基因研究做好物質(zhì)準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 病毒和質(zhì)粒羊傳染性膿皰病病毒ORFV-SY17、原核表達(dá)載體PET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器DL2000 DNA Marker、Primerstar Max、T4DNA連接、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industrues公司；鎳離子親和層析柱購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher生物公司；瓊脂糖核酸膠回收試劑盒、大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；異丙基2-β2-D硫代半乳糖苷(IPTG)、考馬斯亮藍(lán)等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；蛋白濃縮柱購(gòu)自美國(guó)密理博公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)sigma公司；病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)analytik jena生物科技公司。

1.3 目的蛋白結(jié)構(gòu)分析使用蛋白生物學(xué)分析軟件DNAstar對(duì)ORFV122蛋白的基本生物信息進(jìn)行分析，對(duì)ORFV122蛋白的抗原位點(diǎn)、親水區(qū)、疏水區(qū)等信息進(jìn)行預(yù)測(cè)[14]。通過(guò)Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ORFV122蛋 白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中找到目的基因序列,利用Primer Premire 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物,ORFV122-F 5′-CCGGAATTCATGGCG-AACAGGCTCGTGTT-3′；ORFV122-R 5′-CCCA-AGCTTCTAACCGTCGATCTCCATGG-3′;擴(kuò)增片段大小為972 bp。

1.5 ORFV122基因的擴(kuò)增以提取的ORFV基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增ORFV122基因。按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的25 μL體系與條件進(jìn)行操作，設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增出的ORFV122基因片段與PET-28a載體，并把酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)中，37℃培養(yǎng)1 h后把菌液均勻的涂在卡那板上。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜并挑取若干單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，并把菌液進(jìn)行測(cè)序，把測(cè)序成功的菌液做保菌處理并放入-80℃冰箱保存。

1.7 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)在菌液測(cè)序成功后接種于800 mL含有100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中。37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液，并進(jìn)行SDS-PAGE用于鑒定是否有目的蛋白的表達(dá)。

1.8 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1.8.1誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 將6支裝有相同菌液的試管37℃、180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2，4，6，8，10，12 h。從每支試管中取等量的菌液制備SDS-PAGE樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.8.2誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 將6支裝有相同菌液的試管搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG分別在16，18，20，25，30，37℃下誘導(dǎo)8 h。從每支試管中取等量的菌液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導(dǎo)溫度。

1.8.3IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將7支裝有相同菌液的試管搖床震蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度分別0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2,1.5 mmol/L的IPTG 37℃搖床誘導(dǎo)8 h。從每支試管中取等量的菌液制備SDS-PAGE樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.9 目的蛋白的表達(dá)、純化和濃縮將800 mL表達(dá)目的蛋白的菌液37℃搖床培養(yǎng)至D600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h，待誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)束后以6 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀物。棄去上清，用PBS溶液重懸后超聲裂解菌體，4℃、12 000 r/min離心10 min并收集上清，使用Ni+-IDA金屬螯合蛋白質(zhì)純化柱純化目的蛋白。按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，收集洗脫液。并將收集的洗脫液置于蛋白濃縮柱進(jìn)行濃縮，蛋白濃縮后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 目的蛋白免疫小鼠在一免時(shí)取等量的目的蛋白與弗氏完全佐劑混合然后置于震蕩器上在四度的環(huán)境中震蕩過(guò)夜，待其完全乳化后使用注射器吸取0.2 mL并在小鼠皮下多點(diǎn)注射。在第二免、三免以及四免過(guò)程中乳化劑使用的是弗氏不完全佐劑其余步驟與一免一致。

1.11 Western blot法檢測(cè)抗體的特異性將目的蛋白制樣后通過(guò)SDS-PAGE電泳之后再轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中37℃封閉。1 h 后將PVDF膜重新置于由PBST稀釋的免疫血清中(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。PBST洗3～5次，每次5～8 min。加入經(jīng)PBST稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶10 000稀釋)37℃孵育1 h后，PBST洗膜3次，每次5～10 min，然后用DAB顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 目的蛋白抗原預(yù)測(cè)結(jié)果根據(jù)軟件DNAstar對(duì)目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位、親水性等參數(shù)的分析見(jiàn)圖1，根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)信息比對(duì)可知目的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。通過(guò)以上分析目的蛋白有較好的親水性，而且抗原指數(shù)得分也較高，故推測(cè)該目的蛋白作為抗原會(huì)產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。

圖1 目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位、親水性等參數(shù)的分析結(jié)果(由上到下不同的區(qū)域依次代表了目的蛋白疏水區(qū)和親水區(qū)、目的蛋白α螺旋、目的蛋白β折疊、 抗原性指數(shù)、目的蛋白表面可及性)

圖2 目的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

2.2 ORFV122基因PCR擴(kuò)增提取ORFV的基因組，并將其作為模版，PCR擴(kuò)增ORFV122基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)期片段大小(972 bp)基本一致(圖3)。

圖3 PCR擴(kuò)增ORFV122基因電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；1.ORFV122基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定對(duì)固體培養(yǎng)基上挑取的10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖4)以便排除假陽(yáng)性。將可以擴(kuò)增出目的基因的菌液送至公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與ORFV122基因進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)一致的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。

圖4 重組質(zhì)粒為模版PCR擴(kuò)增ORFV122基因電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；1～10.挑取的10個(gè)陽(yáng)性克隆的菌液PCR結(jié)果

2.4 目的蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1目的蛋白誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 完成誘導(dǎo)后分別在不同試管中取相同菌液制備SDS-PAGE樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果是誘導(dǎo)8 h時(shí)蛋白的表達(dá)最優(yōu)(圖5)。

圖5 目的蛋白在不同的誘導(dǎo)時(shí)間時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 M.蛋白質(zhì)Marker；1～6.分別是在誘導(dǎo)2，4，6，8，10，12 h時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色情況

2.4.2目的蛋白誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 分別在16，18，20，25，30，37℃下誘導(dǎo)6 h的試管中取等量的菌液，用菌液制備SDS-PAGE樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析最佳誘導(dǎo)溫度是30℃(圖6)。

圖6 目的蛋白在不同的誘導(dǎo)溫度時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色情況 M.蛋白質(zhì)Marker；1～6.分別是在16，18，20，25，30，37℃時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色情況

2.4.3誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 分別在相應(yīng)的試管中取相同菌液制備SDS-PAGE樣品。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)效果最好(圖7)。

2.5 目的蛋白的純化和濃縮在誘導(dǎo)結(jié)束后經(jīng)過(guò)離心、超聲、鎳柱結(jié)合以及不同濃度咪唑溶液洗脫等過(guò)程純化目的蛋白，結(jié)果顯示在37 000處出現(xiàn)了目的條帶(圖8)，并把所得到的蛋白經(jīng)蛋白濃縮柱濃縮，得到了純度和濃度較高的重組蛋白,SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖7 目的蛋白在不同的誘導(dǎo)濃度下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 M.蛋白質(zhì)Marker；1～7.分別是在誘導(dǎo)劑濃度在0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mmol/L時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

圖8 目的蛋白在不同的濃度的咪唑洗脫時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 M.蛋白質(zhì)Marker；1～6.分別是濃度為40，60，80，120，160，200 mmol/L咪唑洗脫結(jié)果

圖9 目的蛋白在純化濃縮后SDS-PAGE結(jié)果 M.蛋白質(zhì)Marker；1.純化濃縮后的目的蛋白

2.6 抗體血清的采集在四免之后5～7 d對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血并把血液放置4℃環(huán)境2～4 h，使其自動(dòng)凝集析出血清，3 000 r/min離心10 min。并用注射器吸取上清注入新的離心管中，并放入-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 抗體效價(jià)以及特異性的檢測(cè)對(duì)多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)我們采用間接ELISA的方法，通過(guò)目的蛋白包被、封閉、孵育一抗、二抗再加終止液終止反映，最后在酶標(biāo)儀下測(cè)定450 nm處的吸光值。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到多抗的效價(jià)約為1∶80 000。用ORFV野毒型感染OFTU細(xì)胞，在感染48 h后收集細(xì)胞裂解液制成SDS-PAGE樣品，進(jìn)行Western blot檢測(cè)多抗的特異性，結(jié)果顯示在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了特異性條帶(圖10)。此外，使用該抗體對(duì)ORFV122蛋白的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究(圖11)，發(fā)現(xiàn)ORFV122蛋白為早期表達(dá)蛋白，隨著時(shí)間的推移表達(dá)量逐漸增加。

圖10 多抗特異性檢測(cè)結(jié)果 M.蛋白質(zhì)Marker；1.內(nèi)參β-actin；2.ORFV122蛋白

圖11 不同感染病毒時(shí)間ORFV122蛋白表達(dá)量的變化情況

3 討論

在對(duì)ORFV122蛋白進(jìn)行生物學(xué)同源性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白和VACV的A51R基因所編碼的蛋白有較高的同源性。通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知A51R基因除了為毒力基因外其編碼的蛋白還和宿主細(xì)胞的微管細(xì)胞骨架相互作用，保護(hù)宿主微管細(xì)胞骨架不發(fā)生解聚，并且與宿主細(xì)胞骨架相互作用的能力是A51R的保守特性。ORFV122和VACV A51R有著較高的同源性，根據(jù)對(duì)A51R的研究來(lái)對(duì)ORFV122的功能做出假設(shè)，這就進(jìn)一步為ORFV122蛋白進(jìn)一步研究指明方向。

通常羊傳染性膿皰病是根據(jù)病理檢查和臨床體征進(jìn)行診斷的，但在疾病早期，由于該病和羊痘、小反芻獸疫以及口蹄疫的臨床癥狀較為相似，所以想要準(zhǔn)確的辨別該病十分困難。特異性抗體無(wú)論在臨床診斷還是實(shí)驗(yàn)室研究中都有廣泛的應(yīng)用。制備的多克隆抗體可用于ELISA、Western blot和免疫組織學(xué)等檢測(cè)方法的診斷和流行病學(xué)研究，還可以通過(guò)免疫沉淀，免疫熒光，免疫金測(cè)定和免疫組織化學(xué)檢測(cè)病毒的進(jìn)入和定位來(lái)研究致病機(jī)制，并開(kāi)發(fā)可能的亞單位疫苗和治療藥物。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，成功的制備ORFV122蛋白的多克隆抗體，通過(guò)檢測(cè)多抗的效果良好。ORFV122蛋白多抗的制備為該疾病的診斷和進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)，也為ORFV122基因的生物學(xué)特性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。