李佩國，張召興，李蘊玉，賈青輝，張香齋

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島 066604；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000)

△Jointfirstauthors

雞致病性大腸桿菌病是危害蛋、肉雞主要傳染性疾病之一，該病是由不同血清型的致病性大腸桿菌引起雞一系列癥狀疾病的總稱，該菌感染途徑廣泛，對不同日齡的雞均有致病性，尤其是對雛雞感染率和死亡率均較高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。E.coli是臨床中主要人畜共患的病原菌，其血清型眾多復(fù)雜，不同血清型的菌株之間缺乏免疫保護性，沒有有效疫苗進行預(yù)防，抗生素成為防治雞致病性大腸桿菌病主要的手段[3]。隨著抗生素反復(fù)的使用，改變了E.coli的耐藥機制，不僅產(chǎn)生很強的耐藥性，還造成蛋、肉等畜產(chǎn)品中嚴重的藥物殘留，并威脅著人們的健康[4]。中藥富含皂苷、多糖、黃酮等多種生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以動物體內(nèi)細胞、組織及器官，在機體內(nèi)通過種途徑方式調(diào)節(jié)細胞、體液免疫機能，同時可以誘導(dǎo)細胞因子基因調(diào)控與表達，在抗菌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等多方面起著重要的作用。許多研究表明了中藥在蛋、肉雞細菌性疾病具有良好防治效果，被廣泛應(yīng)用于蛋、肉雞養(yǎng)殖業(yè)中[5-6]。中藥由于細胞壁結(jié)構(gòu)致密，普通的粉碎不能將其有效活性成分完全釋放，影響中藥在機體內(nèi)生物利用，超微粉碎使中藥有效活性成分完全釋放，可以提高中藥在腸道內(nèi)生物利用率，因而提高藥效，并彌補中藥普通粉碎缺陷[7-8]。目前，國內(nèi)關(guān)于復(fù)方中藥超微粉對人工感染雛雞致病性E.coli地方株后血清中免疫生化指標影響報道較少。因此，本試驗選用致病性E.coli地方流行株，建立病理模型，進一步探討復(fù)方中藥超微粉對雛雞人工感染致病性E.coli地方株后血清中免疫生化指標影響，為研究復(fù)方中藥超微粉防治雞致病性大腸桿病作用機理及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物1日齡的健康海蘭灰雛雞300只，購于秦皇島市金牧種雞場，飼養(yǎng)至14日齡，選擇體質(zhì)量相近的健康雞為試驗所用。

1.2 主要試劑與儀器畜禽頭孢噻呋鈉(含量≥90%)購于天津市中升挑戰(zhàn)生物工程有限公司；總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、溶菌酶檢測試劑盒(LZM)等試劑盒均購于南京建成生物工程公司；免疫球蛋白IgG，IgM，IgA 等ELISA Kit試劑盒均購于Elabscience公司。超微量分光光度計(ND2000C型)由德國Thermo公司生產(chǎn)；Infinite酶標儀(M200PRO型)由TECAN公司生產(chǎn)；小型高速離心機(5804R型)由德國EPPENDOR公司生產(chǎn)；超微粉機(WK-150)由青州市精誠醫(yī)藥制造有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗菌株計數(shù)臨床中分離的雛雞致病性E.coli地方流行株，其血清為O78，對14日齡雛雞的半數(shù)致死量(LD50)為2.5×107CFU/mL，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。將試驗菌株菌種室溫復(fù)蘇后，無菌條件下接種于伊紅美藍培養(yǎng)上，挑取單個菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中復(fù)壯，培養(yǎng)置對數(shù)期，利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整菌液濃度為2.5×107CFU/mL。

1.4 試驗中藥制備根據(jù)雞致病性大腸桿菌病的中獸醫(yī)理論辨證觀點，選擇體外抑菌敏感單味中草藥作為主藥，再根據(jù)各種單味中藥配伍中君、臣、佐、使的藥理性質(zhì)組合成中藥復(fù)方制劑[9-11]，復(fù)方中藥(白頭翁20 g、白芍15 g、五倍子15 g、連翹10 g、蒲公英10 g甘草15 g、黃芪15 g、麥冬10 g、土茯苓10 g、當(dāng)歸5 g)，用普通粉碎機粉碎過篩，再用超微粉碎機粉碎過篩，通過測量復(fù)方中藥超微粉的粒徑，該制劑的粒徑主要集中在 8.57～13.65 μm之間，符合中草藥超微粉粒徑的范圍。

1.5 試驗設(shè)計與測定指標參考文獻[11]，采用單因素設(shè)計試驗，將180只14日齡雛雞隨機分成6組，每個組3個重復(fù)，每個重復(fù)10只，1組為陰性對照，2組為陽性對照，3組為抗生素組，在基礎(chǔ)日糧中添加1%頭孢噻呋鈉， 4～6組分別在基礎(chǔ)日糧中添加1.5%、2.0%、2.5%復(fù)方中藥超微粉，連續(xù)飼喂7 d。除1組外，于分組當(dāng)天每只雞攻E.coli2.5×107CFU，停藥后繼續(xù)飼養(yǎng)14 d。于試驗的第7、14、21 天，每組隨機抽取10只雛雞采血分離血清。按照說明書測定血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、TP、ALB、GLB、GPT、GOT、BUN、UA、TG、TC、LZM等免疫生化指標。

1.6 試驗數(shù)處理采用SPSS19.0進行F值方差分析與多重比較，用P<0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 對雛雞人工感染致病性E.coli后血清中免疫指標的影響

2.1.1血清中IgG含量 由圖1可知，試驗7 d，5、6組的血清中IgG含量顯著高于2組(P<0.05)，與1、3、4組比較均差異性不顯(P>0.05)；試驗14，21 d，4、5、6組的血清中IgG含量均顯著高于2、3組(P<0.05)，但與1組比較無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組雞血清中IgG含量檢測結(jié)果 1.肩標小寫字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)；2.肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.1.2血清中IgM含量 由圖2可知，試驗7 d，5、6組血清中IgM含量顯著高于2組(P<0.05)，與1、3、4組相比差異性不顯著(P>0.05)；試驗14，21 d，5、6組血清中IgM含量均顯著高于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組雞血清中IgM含量檢測結(jié)果

2.1.3血清中IgA含量 由圖3可知，試驗7 d，各組血清IgA含量均差異性不顯著(P<0.05)；試驗14，21 d，5、6組血清IgA含量均顯著高于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異不顯著(P>0.05)。2、3組之間以及4、5、6組之間均差異不顯著(P>0.05)。

圖3 各組雞血清中IgA含量檢測結(jié)果

2.2 對雛雞人工感染致病性E.coli后血清中生化指標的影響

2.2.1血清中TP含量 由圖4可知，試驗7 d，1、6組血清中的TP含量顯著高于2、3、4、5組(P<0.05)，4、5組的TP含量雖有升高趨勢，但與2、3組比較差異不顯著(P>0.05)；試驗14 d，5、6組血清中的TP含量顯著高于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異性不顯著(P>0.05)；試驗21 d，4、5、6組血清中的TP含量均顯著高于1、2、3組(P<0.05)，但1、2、3組之間以及4、5、6組之間的差異不顯著(P>0.05)。

圖4 各組雞血清中TP含量檢測結(jié)果

2.2.2血清中ALB含量 由圖5可知，試驗7 d，各組血清中的ALB含量均差異性不顯著(P<0.05)；試驗14 d，5、6組血清中的ALB含量顯著高于2組(P<0.05)，與1、3、4組相比差異不顯著(P>0.05)；試驗21 d，5組血清中的ALB含量均顯著高于2、3組(P<0.05)，與1、4、6組相比差異性不顯著(P>0.05)。

2.2.3血清中GLB含量 由圖6可知，試驗7 d，1、6組血清中的GLB含量均顯著高于2、3組(P<0.05)， 但與4、5組相比差異性不顯著(P>0.05)。試驗14、21 d，5、6組血清中的GLB含量均顯著高于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異性不顯著(P>0.05)，而1、2、3、4組之間以及4、5、6之間的差異不顯著(P>0.05)。

圖5 各組雞血清中ALB含量檢測結(jié)果

圖6 各組雞血清中GLB含量檢測結(jié)果

2.3 血清中GPT、GOT活性與TC、TG含量

2.3.1血清中GPT活性 由圖7可知，試驗7，21 d，5、6組血清中的GPT含量均顯著低于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異性不顯著(P>0.05)；試驗14 d，5、6組血清中的GPT含量均顯著低于2、3、4組(P<0.05)，與1組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖7 復(fù)方中藥超微粉對雛雞血清中GPT含量檢測結(jié)果

2.3.2血清中GOT活性 由圖8可知，試驗7 d，5、6組血清中的GOT含量顯著低于2、3、4組(P<0.05)，與1組相比差異不顯著(P>0.05)；試驗14，21 d，4、5、6組血清中的GOT含量顯著低于2、3組(P<0.05)，與1組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖8 各組雞血清中GOT含量檢測結(jié)果

2.3.3血清中TC含量 由圖9可知，試驗7 d，5、6組血清中TC含量均顯著低于2、3、4組(P<0.05)，與1組相比差異不顯著(P>0.05)；試驗14，21 d，5、6組血清中TC含量均顯著低于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異不顯著(P<0.05)。

圖9 各組雞血清中TC含量檢測結(jié)果

2.3.4血清中TG含量 由圖10可知，試驗7 d，5、6組血清中TG含量均顯著低于2、3、4組(P<0.05)，與1組相比差異不顯著(P>0.05)；試驗14，21 d，4、5、6組血清中TG含量均顯著低于2、3組(P<0.05)；與1組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.4 血清中BUN和UA的含量

2.4.1血清中BUN含量 由圖11可知，4、5、6組各期的血清BUN含量雖然呈降低趨勢，但與1、2、3組比較未達到差異水平(P>0.05)。

2.4.2血清中UA含量 由圖12可知，試驗7 d，各組血清中UA含量均差異性不顯著(P>0.05)；試驗14，21 d，5、6組血清中UA含量均顯著低于2、3組(P<0.05)，與1、4組相比差異不顯著不顯著(P>0.05)。

圖10 各組雞血清中TG含量檢測結(jié)果

圖11 各組雞血清中BUN含量檢測結(jié)果

圖12 各組雞血清中UA含量檢測結(jié)果

2.5 血清中LZM的含量由圖13可知，試驗7 d，5、6組血清中LZM含量均顯著高于2、3、4組(P<0.05)；與1組相比差異不顯著(P<0.05)；試驗14 d，5、6組血清中LZM含量均顯著高于1、2、3、組(P<0.05)，與4組比較無顯著差異(P>0.05)；試驗21 d，4、5、6組血清中LZM含量均顯著高于1、2、3組(P<0.05)，而1～3組之間以及4～6組之間的差異不顯著 (P>0.05)。

圖13 各組雞血清中LZM含量檢測結(jié)果

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥超微粉對雛雞血清中免疫指標影響免疫球蛋白IgG、IgM、IgA是介導(dǎo)體液免疫的主要的蛋白活性物質(zhì)，在機體的免疫應(yīng)答中起著重要的作用，是評價動物機體的免疫機能的重要的指標之一[12-13]。王曉姍[14]和高俊波等[15]研究表明,復(fù)方中藥可以提高雞血清中免疫球蛋含量。本試驗結(jié)果表明，與陽性對照和抗生素組相比，添加2.0%和2.5%復(fù)方中草藥超微粉可使人工感染致病性E.coli后的血清IgG、IgM、IgA含量顯著高于陽性對照和抗生素組，與陰性對照無顯著差異。這可能是復(fù)方中藥經(jīng)超微后，使之有效成分溢出，刺激體內(nèi)T細胞生成、活化，促進T細胞轉(zhuǎn)化成漿細胞分泌抗體，提高機體免疫機能，抵抗外界致病性E.coli感染。

3.2 復(fù)方中草藥超微粉對雛雞血清生化指標的影響

3.2.1對血清TP、ALB、GLB含量的影響 動物機體的TP含量主要包括ALB和GLB，ALB主要作用維持滲透壓、調(diào)節(jié)代謝和運輸營養(yǎng)物質(zhì)，GLB主要引起炎性反應(yīng)，抵抗外來的病原微生物，因此血清中TP水平是評價動物物質(zhì)代謝、免疫機能重要指標之一[16-17]。相關(guān)研究表明，雛雞感染致病性E.coli后，可以造成不同程度的肝臟內(nèi)皮網(wǎng)狀組織和肝細胞損傷，并形成肝周炎，影響GLB和ALB合成與分泌，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫機能[18-19]。本試驗結(jié)果表明，與陽性對照組和抗生素組相比，2.0%和2.5%添加組可提高雛雞人工感染致病性E.coli后血清中TP、ALB和GLB水平，且與正常雛雞血清中TP，ALB和GLB無明顯差異。由于復(fù)方中藥中有效成分可以改善和修復(fù)致病性E.coli造成肝臟不同的損傷，提高肝臟代謝水平和免疫機能狀況。與索朗扎西等[19]報道的一致。

3.2.2對血清GPT、GOT活性與TC、TG含量的影響 GPT和GOT存在動物肝臟中肝細胞及其他細胞線粒體內(nèi)，與機體的物質(zhì)代謝有關(guān)，由于某種因素導(dǎo)致肝臟受到損傷時，可使血清中的GPT和GOT的活性增強，血清中的GPT和GOT的水平是評價肝臟功能重要指標[20]。肝臟是機體內(nèi)脂類主要的代謝器官，動物體內(nèi)脂類物質(zhì)主要來源于飼料和肝臟的合成，其中TC主要由肝臟合成貯存于肝臟，參與體內(nèi)激素合成和物質(zhì)代謝，當(dāng)肝臟受到損傷時，體內(nèi)的脂類物質(zhì)代謝障礙，血清中的TG和TC含量就會增高[21-22]，并嚴重影響動物的生產(chǎn)性能[23]。本試驗結(jié)果表明，與陽性對照組及抗生素比較，添加2.0%和2.5%復(fù)方中草藥超微粉可顯著降低雛雞人工感染致病性E.coli后7，14，21 d血清GPT、GOT、TG和TC的含量，從而證實了該制劑可以改善雛雞人工感染致病性E.coli后的肝功能，對肝臟的損傷具有修復(fù)的作用，改善雛雞體內(nèi)脂類的代謝水平，從而促進雛雞的生長。其結(jié)果與索朗扎西等[19]、官麗輝等[20]等、姜賀等[24]報道的一致。

3.2.3對血清BUN和UA含量的影響 腎臟是禽類主要的排泄器官，其蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)最終的代謝產(chǎn)物以尿氮、尿酸的形式排除體外，BUN和UA是機體內(nèi)蛋白質(zhì)及氨基酸代謝產(chǎn)物，當(dāng)腎功能不正常時，血清中BUN和UA濃度就會升高，因此，BUN和UA是反映腎功能的主要指標[25]。張立永[26]研究表明，復(fù)方中藥可以降低雛雞感染E.coli后的血清中BUN含量。本試驗結(jié)果表明，添加2.0%和2.5%復(fù)方中草藥超微粉可減低人工雛雞感染致病性E.coli后血清中BUN和UA含量，與陰性對照組無明顯現(xiàn)差異，其中UA最為明顯，與陽性對照和抗生素比較達顯著水平，從而減少對腎臟的損傷，提高腎臟的代謝水平。

3.2.4雛雞血清中LZM含量的影響 溶菌酶(LZM)是由動物體內(nèi)多種吞噬細胞合成或分泌的一種具有較強抗菌活性的蛋白質(zhì)，對外來的病原微生物通過吞噬細胞的吞噬和包裹后，將其直接殺死水解消化后排出胞外[27]。LZM具有抗菌廣譜、抗菌活性穩(wěn)定等多種優(yōu)點，對大腸桿菌、傷寒沙門菌等病原菌具有直接溶解殺滅作用，同時還可以刺激機體產(chǎn)生補體及IgA，對病原菌進行間接溶解與殺滅[28]。張建[29]研究表明，復(fù)方中草藥制劑能提高雛雞血清中的LYZ的含量。邱妍等[30]研究表明，復(fù)方中藥可以提高免疫抑制狀態(tài)下小鼠血清中LYZ的含量。本試驗結(jié)果表明，添加2.0%和2.5%復(fù)方中草藥超微粉可使雛雞人工感染致病性E.coli后4，14，21 d的血清中LYZ含量顯著升高，從而提高機體的殺菌或者抗菌能力，抑制或殺死者外界入侵的致病性E.coli，同時也提高雛雞的抵抗力。