于金玲，高蓓敏，沈衛(wèi)達(dá)，崔 靜，王浩峰，朱江帆

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院普外科，上海 200120；2.上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院乳腺科，上海 200051）

目前，乳腺癌仍位居女性惡性癌腫發(fā)病首位［1］。三陰性乳腺癌（thriple?negative breast cancer，TNBC）是一種特殊類型的乳腺癌亞型，雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體（human epi?dermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)均陰性，缺乏治療靶點(diǎn)，容易復(fù)發(fā)及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，5年生存率不足 30%［2］。除化療外，尚缺乏其他有效治療措施。因此，迫切需要尋求新的靶標(biāo)治療分子［3］。環(huán)狀 RNAs（circRNAs）是一類特殊的非編碼RNA，具有高度穩(wěn)定性和組織特異性［4］。而微小RNA（miRNA）在真核細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育分化等發(fā)揮重要的調(diào)控作用［5］。近期研究表明，circRNA 具有 miRNA 應(yīng)答元件（microRNA response elements，MREs），通 過(guò) 與 靶 miRNA 結(jié) 合，作 為miRNAs 海綿體，發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用，調(diào)控相關(guān)RNA 的表達(dá)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR?182?5p 在 TNBC 中高表達(dá)可下調(diào)MTSS1 水平，促進(jìn)TNBC 轉(zhuǎn)移，并通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，hsa＿circ＿USP42 在 TNBC 中差異下調(diào)表達(dá)；靶miRNA 預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA hsa＿circ＿USP42 在 371～377 堿基具有 miR?182?5p 可能的結(jié)合位點(diǎn)［7］。本研究通過(guò)分析 hsa＿circ＿USP42對(duì)TNBC 細(xì)胞株體外增殖、凋亡的影響，初步探討circ＿USP42 靶向結(jié)合 miR?182?5p 在 TNBC 中發(fā)揮的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得上海長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào) CNFBLLQKW?2016003）。收集完整的TNBC 患者臨床及病理資料，并收集石蠟包埋的癌及癌旁組織；納入患者共30 例，為2010年1月至2015年12月期間在上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院接受乳腺癌改良根治的患者。所有患者均獲得知情同意?；颊呋€資料：年齡 30 ～70 歲，平均（48.67±9.65）歲；絕經(jīng)18 例，未絕經(jīng)者12 例；淋巴結(jié)陰性患者9 例，淋巴結(jié)陽(yáng)性患者 21 例；腫瘤病理分期：Ⅰ期和Ⅱ期患者共24 例，Ⅲ期患者6 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受過(guò)放療及化療，全部標(biāo)本經(jīng)兩位病理科副主任醫(yī)師讀片，組織病理學(xué)確診浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。有同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1 枚以上或者腫瘤直徑＞5 cm 者，術(shù)后給予放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過(guò)放療及新輔助化療者；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；特殊病理類型乳腺癌。

1.2 材料與試劑

MDA?MB?231 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于 Gibco 公司（貨號(hào) 16000?044）；LipofectAMINETM3000 購(gòu)于 Invitrogen 公司（貨號(hào) L3000015）；CCK8 試劑購(gòu)于同仁化工研究所；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于 TaKaRa 公司（貨號(hào)9109）。

1.3 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于 Thermo 公司（貨號(hào) 3111）；熒光定量 PCR 儀購(gòu)自 ABI 公司（貨號(hào) ViiA7／7500）；RT?PCR 反應(yīng)膜購(gòu)自ABI（貨號(hào)4311971）；電熱恒溫水槽購(gòu)自精宏科技（貨號(hào)DK?8D）；酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN 公司（M100 PRO）；倒置顯微鏡購(gòu)于Olympus 公司（貨號(hào) IX73）。

1.4 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建帶有目的基因 hsa＿circ＿0007823 circRNA至 psiCHECK2 載體和 pLCDH?ciR 載體中。將提取的質(zhì)粒 pUC57?hsa＿circ＿0007823 與載體 pLCDH?ciR分別通過(guò)EcoRI／BamHI 進(jìn)行雙酶切；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，選取酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行大量提取。

1.5 細(xì)胞增殖及遷移實(shí)驗(yàn)

1.5.1 CCK8 實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)液輕輕吹打細(xì)胞至均勻的細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，按1×104／孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞懸液鋪于96 孔板中，四周用 100 μL PBS 填充。將鋪好的 96 孔板放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。實(shí)驗(yàn)分為 2 組，空載轉(zhuǎn)染組和circRNA 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，每組6 復(fù)孔。將 96 板在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 48 h，孵育時(shí)間結(jié)束，每孔加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 吸光度（A450），繪制細(xì)胞活力曲線。

1.5.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h 后，棄去6 孔板原有培養(yǎng)基，加胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用0.1% BSA 培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞密度為2×105／mL，取上述細(xì)胞懸液 200 μL 接種于 Transwell小室中，下室放置含2.5% FBS 的培養(yǎng)基，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)24 ～48 h 后取出，棄掉上清液，加入無(wú)菌PBS，洗2 次，室溫下用4%多聚甲醛固定10 min，然后棄除4%多聚甲醛，無(wú)菌PBS 洗2次，室溫下再用結(jié)晶紫染色20 min，用蒸餾水洗掉小室上多余的結(jié)晶紫，室溫干燥，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞、計(jì)數(shù)并拍照。

1.5.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將人工基質(zhì)膠（20 μg）包被于8 μm 孔徑的Transwell 侵襲小室聚碳酯微孔膜的上表面，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止30 min，使其聚成凝膠。收集轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用0.1% FBS 的培養(yǎng)液制備成 1×106／mL 細(xì)胞懸液，在Transwell 上室中加入200 μL 細(xì)胞懸液，下室中加入 600 μL 含 10% FBS 的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h 后取出Transwell 小室，PBS 潤(rùn)洗，用棉簽去除上室中的基質(zhì)膠和細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 潤(rùn)洗后，結(jié)晶紫室溫染色15 min，蒸餾水沖洗浸泡，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將 circRNA hsa＿circ＿USP42 與 hsa?miR?182?5p的結(jié)合位點(diǎn)前后200 bp 序列克隆構(gòu)建至報(bào)告基因載體psicheck2，同時(shí)合成上述預(yù)測(cè)到的miR?182?5p mimics。收集培養(yǎng)好的 293T 細(xì)胞，用無(wú) PS 的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按每孔4×104個(gè)細(xì)胞，接種至24孔板中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞換成無(wú)血清培養(yǎng)基 a（3 μL LipofectamineTM3000＋25 μL無(wú)血清OMEM 培養(yǎng)液，室溫靜置5min）和無(wú)血清OMEM 培養(yǎng)基 b（100 nmol miRNA?182?5p mi?mics／mimic NC ＋ 500 ng psicheck2 ／psicheck2?ciicRN A＋25 μL）室溫靜置 5 min。將上述中的 a 和 b 混合，室溫靜置20 min。加入制備的轉(zhuǎn)染混合液于細(xì)胞中。去細(xì)胞上清液，加入裂解液充分裂解細(xì)胞后，12 000×g離心 5 min，取上清液。加入 100 μL 螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑，混勻后測(cè)定RLU（relative light unit）。以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照。

1.7 Q?PCR檢測(cè)hsa＿circ＿USP42過(guò)表達(dá)效果及靶miR?182基因的表達(dá)水平

（1） 收集培養(yǎng)好的 TNBC 細(xì)胞 MDA?MB?231，過(guò)表達(dá)hsa＿circ＿USP42。取處理好的細(xì)胞，用 TRIzol試劑（大連寶生物工程有限公司）提取總RNA。以DEPC H2O 為對(duì)照測(cè)定 RNA 純度和定量，取 2 μL RNA 溶液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定樣本的濃度和質(zhì)量。

（2） 用 PrimeScriptTMRT Master 試劑盒（日本TaKaRa 公司）按照說(shuō)明書對(duì)總RNA 進(jìn)行提取并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。qRT?PCR 在 Bio?Rad CFX96 系統(tǒng)（Bio?Rad 公 司） 上 使 用 TB GreenTMPremix Ex TaqTM（TAKARA 公司）進(jìn)行。GAPDH 用作定量circRNA 和 mRNA 的內(nèi)部參考，U6 作為 miRNA 的內(nèi)部參考。結(jié)果與計(jì)算：各樣品的目標(biāo)RNA 和內(nèi)參分別進(jìn)行 real?time PCR 反應(yīng)?；虻南鄬?duì)表達(dá)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物及序列見(jiàn)表1。

表1 各基因的引物及引物序列Tab.1 Primers sequences of each gene

1.8 Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上放置30 min，4 ℃，12 000×g離心 10 min，取上清液。使用 BCA試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司）測(cè)定蛋白濃度。將蛋白液與loading buffer 混勻，放入100 ℃水浴6 min。離心，放置冰上，配制 SDS?PAGE 分離膠。將等量的蛋白加載到凝膠上，電泳后使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂牛奶在37 ℃封閉 2 h。P 孵育一抗，內(nèi)參（1 ∶5 000），目的蛋白（均按1 ∶1 000稀釋），4 ℃，過(guò)夜。孵育二抗（1 ∶5 000），37 ℃，2 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯影（Millipore ECL 發(fā)光液），記錄并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件作圖。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用±s表示（符合正態(tài)分布）或者中位數(shù)與四分位數(shù)間距（不符合正態(tài)分布）的形式表示。組間均值比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hsa＿circ＿USP42在TNBC癌組織中低表達(dá)

qPCR 結(jié)果顯示，TNBC 癌組織中 circRNA USP42 相對(duì)定量（5.969±3.076）低于癌旁組織（20.284±5.444），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-16.469，P＝0.000），見(jiàn)圖1。circRNA USP42 在淋巴結(jié)陽(yáng)性組表達(dá)（3.575±1.612）低于淋巴結(jié)陰性組（6.995±2.999），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.039，P＝0.003）。

2.2 hsa＿circ＿USP42過(guò)表達(dá)抑制TNBC細(xì)胞遷移和侵襲

過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 的細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＝0.028），過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 的細(xì)胞侵襲數(shù)量減少（P＜0.000 1），見(jiàn)圖1。

圖1 circ＿USP42 過(guò)表達(dá)對(duì)TNBC 細(xì)胞遷移及侵襲的影響Fig.1 Effects of circ＿USP42 expression on cell migration and invasion of TNBC cells

2.3 hsa＿circ＿USP42過(guò)表達(dá)抑制TNBC細(xì)胞活力

CCK?8 檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒circRNA hsa＿circ＿USP42 的細(xì)胞活力水平降低（P＝0.000 8），見(jiàn)圖2。

2.4 circRNA結(jié)合的miRNA熒光素酶篩選驗(yàn)證

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)環(huán)狀 RNA hsa＿circ＿USP42 在 371～377 片段有 hsa?miR?182?5p 靶結(jié)合點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，將質(zhì)粒circRNA hsa＿circ＿USP42 與 miR?182?5p mimics 共轉(zhuǎn)染至TNBC 細(xì)胞系 MDA?MB?231，熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）表明 circRNA circ＿USP42 與 miR?182?5p 為有效結(jié)合，見(jiàn)圖3。

圖2 hsa＿circ＿USP42 過(guò)表達(dá)對(duì) TNBC 細(xì)胞株增殖的影響Fig.2 Effects of hsa＿circ＿USP42 expression on cell proliferation of TNBC cells

圖3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果Fig.3 The results of luciferase report assay

2.5 circRNA?miRNA?靶基因驗(yàn)證

在 MDA?MB?231 中過(guò)表達(dá)環(huán)狀 RNA hsa＿circ＿USP42，qPCR 驗(yàn)證 miR?182 及 MTSS1 靶基因表達(dá)水平，Western 印跡法檢測(cè)MTSS1 的蛋白表達(dá)水平。qPCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒circRNA hsa＿circ＿USP42 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，circRNA hsa＿circ＿USP42 的表達(dá)水平升高（P＝0.002 2）；miR?182?5p 的表達(dá)水平降低（P＝0.036），MTSS1 的表達(dá)水平升高（P＝0.001 7），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

Western 印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒circRNA hsa＿circ＿USP42 細(xì)胞的 MTSS1 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.035 4），見(jiàn)圖5。

圖4 hsa＿circ＿USP42 過(guò)表達(dá)后 miR?182?5p 及 MTSS1mRNA 水平變化Fig.4 The expression of miR?182?5p and MTSS1 mRNA in hsa＿circ＿USP42 overexpression cells

圖5 hsa＿circ＿USP42 過(guò)表達(dá)后 MTSS1 蛋白水平變化及灰度分析Fig.5 The expression of MTSS1 protein and gray value in hsa＿circ＿USP42 overexpression cells

3 討 論

TNBC 是一類具有高度異質(zhì)性的乳腺癌，嚴(yán)重危害女性健康。15%～20%的乳腺癌患者為TNBC［8］。在過(guò)去的幾十年中，乳腺癌治療取得了顯著進(jìn)展，總體死亡率下降。然而，TNBC 病理組織學(xué)分級(jí)差，腫瘤侵襲性強(qiáng)，容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。目前TNBC 治療仍以化療為主，尚缺乏內(nèi)分泌及抗HER2 治療靶點(diǎn)，3年后復(fù)發(fā)率可達(dá) 40%～50%［9］，預(yù)后仍然很差。因此，鑒定更多用于治療TNBC 的抗癌分子靶標(biāo)具有重要意義。

CircRNA 是一類以共價(jià)閉環(huán)為特征的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，來(lái)源于基因的外顯子或內(nèi)含子，具有物種保守性及組織特異性。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和計(jì)算分析的發(fā)展，越來(lái)越多的circRNA 被發(fā)現(xiàn)，其在疾病發(fā)生中的調(diào)控作用也越來(lái)越被重視［10］。相比線性 RNA 分子，circRNA 具有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有 5′?3′的極性和 polyA 尾巴，因此不容易被RNA 核酸外切酶或者RNaseR 降解，更穩(wěn)定［11］。大多 circRNAs 來(lái)源于外顯子，具有可以結(jié)合 miRNA 的 MREs。circRNAs 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)豐度較高，具有組織特異性，相對(duì)保守。circRNAs 的上述特性決定了它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后的重要作用，可作為疾病診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。

CircRNA 可作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA）分子，可能通過(guò)影響靶miRNA 與下游靶mRNA 結(jié)合而發(fā)揮作用［12］。有研究證明，在不同物種中，circRNA 可以發(fā)揮miRNA 海綿體的作用，通過(guò)與miRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，作為ceRNA，調(diào)控靶mRNA 的表達(dá)［13?14］，在疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用，作為潛在的疾病預(yù)后因子及治療靶點(diǎn)［15］。約 30%以上的circRNA 發(fā)揮 miRNA 的 ceRNA 作用，形成 circRNA?miRNA?mRNA 多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控基因的表達(dá)。Piwecka 等［16］驗(yàn)證了環(huán)狀 RNA Cdr1as 大約有 1 500個(gè)核苷酸，可能發(fā)揮海綿作用吸附miRNA 的作用。

microRNA 是較短的 RNA 分子，通常結(jié)合到mRNA 的互補(bǔ)序列上，因而控制著細(xì)胞產(chǎn)生的特定蛋白數(shù)量，發(fā)揮抑癌或促癌作用［17?18］。研究探索了miR?182 對(duì) TNBC 細(xì)胞行為的作用，表明 miR?182在TNBC 組織和細(xì)胞中上調(diào)，可促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖和侵襲，并證明 miR?182 可能通過(guò)下調(diào)靶mRNA 表達(dá)促進(jìn) TNBC 細(xì)胞增殖和遷移［19?20］。本課題組前期進(jìn)行了 TNBC circRNA 測(cè)序，建立了circRNA 差異表達(dá)譜，挑選出差異表達(dá)顯著的circ＿USP42 作為進(jìn)一步研究對(duì)象。靶miRNA 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，miR?182?5p 是與 hsa?circ?USP42 結(jié)合力最強(qiáng)的5 個(gè)miRNA 之一。進(jìn)一步通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa＿circ＿USP42 在 371 ～377 及 412 ～419 兩個(gè)堿基序列與 miR?182?5p 有潛在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 與 has?mir?182?5p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后熒光素酶活性顯著降低，說(shuō)明circRNA circ＿USP42 與 miR?182 有效結(jié)合。在本研究中，hsa＿circ＿USP42 在 TNBC 癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織；在TNBC 淋巴結(jié)陽(yáng)性組表達(dá)更低。在 TNBC 細(xì)胞株 MDA?MB?231 中過(guò)表達(dá) hsa＿circ＿USP42，細(xì)胞的侵襲和遷移明顯受到抑制，提示hsa＿circ＿USP42 可能發(fā)揮 miR?182?5p 的海綿調(diào)控作用，影響TNBC 的發(fā)生發(fā)展。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí) hsa＿circ＿USP42 與 miR?182?5p 有效結(jié)合；過(guò)表達(dá) hsa＿circ＿USP42 后，靶 miRNA miR?182?5p顯著下調(diào)，而靶基因MTSS1 在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均升高，提示 hsa＿circ＿USP42 可能發(fā)揮 miR?182?5p海綿作用，上調(diào)MTSS1 表達(dá)，抑制TNBC 侵襲及轉(zhuǎn)移，在TNBC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用；hsa＿circ＿USP42 與 miR?182?5p 的靶結(jié)合位點(diǎn)可能是TNBC 的潛在治療靶點(diǎn)。

未來(lái)需要體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明hsa＿circ＿USP42 作為 miR?182?5p 海綿調(diào)控體內(nèi)機(jī)制。hsa＿circ＿USP42／miR?182?5p／MTSS1 軸對(duì) TNBC 復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，有待進(jìn)一步研究。