劉鵬飛，馬文靜，趙愛華，譚天浩，趙 倩，俞作仁

（1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200120；2.甘肅省武威市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 武威 733000）

2019年12月，我國(guó)武漢市暴發(fā)了新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID?19）疫情。截止2020年2月底，全球已經(jīng)有接近80 000 例確診患者，近3 000 例感染者死亡。由于新型冠狀病毒（SARS?CoV?2）傳染性強(qiáng)、傳播速度快、潛伏期長(zhǎng)，并且部分無(wú)癥狀患者具有傳染性，增加了其隱蔽性和感染力。COVID?19 臨床癥狀、傳播規(guī)律與2003年我國(guó)暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）及 2012年中東國(guó)家暴發(fā)的中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）既有相同之處，也有不同之處。分析SARS?CoV?2 基因組序列及COVID?19 病理特征、臨床癥狀，將有助于尋找有效的預(yù)防和治療手段。本文對(duì)SARS?CoV?2 基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、抗病毒藥物篩選和研發(fā)進(jìn)展及 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)抗 SARS?CoV?2 的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 SARS?CoV?2的結(jié)構(gòu)和序列特征

冠狀病毒（coronaviruses，CoVs）是一種 RNA病毒，因在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)病毒包膜上有大量類似冠狀的棘突，故命名為冠狀病毒。冠狀病毒基因組是一個(gè)27～32 kb 正義的單鏈RNA，其中ORF1a和ORF1b 約占基因組的2／3，它們編碼2 個(gè)大的重疊多蛋白，最終被加工成RNA 依賴的RNA 聚合酶及其他參與RNA 合成或宿主反應(yīng)調(diào)節(jié)的非結(jié)構(gòu)蛋白；基因組的另外1／3 主要負(fù)責(zé)編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白和其他輔助蛋白［1］。4 種結(jié)構(gòu)蛋白為棘突蛋白（spike glycoprotein，S）、包膜蛋白（envelope protein，E）、膜蛋白（membrane protein，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。根據(jù)最新的國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)（ICTV）分類，冠狀病毒分為4 個(gè)屬（α?CoVs、β?CoVs、δ?CoVs 和 γ?CoVs）［2］。冠狀病毒會(huì)引起各種家畜、野生動(dòng)物以及人類的疾病，其中α?CoVs 和 β?CoVs 主要感染哺乳動(dòng)物，而 γ?CoVs 和 δ?CoVs 主要感染鳥類［2?3］。目前，已鑒定出 7 種可以感染人類的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoVs），其中包括 α?CoVs 屬的 HCoV?NL63 和 HCoV?229E，β?CoVs 屬的 HCoV?OC43、HCoV?HKU1、SARS?CoV［4］、MERS?CoV［5］和 SARS?CoV?2［6］。不同類型的冠狀病毒的致病能力存在較大差異，部分冠狀病毒如HCoV?OC43 和HCoV?229E 是造成普通流行性感冒的主要原因；而有些冠狀病毒感染可能引發(fā)嚴(yán)重的疾病，甚至威脅生命，例如由 SARS?CoV 引起的 SARS、由 MERS?CoV 引起的 MERS 和由 SARS?CoV?2 引起的 COVID?19，都造成了大范圍的感染和大量患者的死亡［7］。進(jìn)入21 世紀(jì)短短20年以來(lái)，已暴發(fā)3 次由冠狀病毒引起的重大傳染?。⊿ARS、MERS 和 COVID?19），這深刻警示我們，必須加強(qiáng)對(duì)這類病毒的研究，重視對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。

SARS?CoV?2 的基因組由 29 891 個(gè)核苷酸組成，共編碼9 860 個(gè)氨基酸，具有典型的β?CoV 基因組結(jié)構(gòu)：5′非翻譯區(qū)（UTR）、ORF1ab、S 基因、E 基因、M 基因、N 基因、3′UTR 及一些不確定的非結(jié)構(gòu)性開放閱讀框［8］。SARS?CoV?2 基因組共包含 14個(gè)編碼27 種蛋白質(zhì)的開放閱讀框。位于基因組5′末端的ORF1ab 基因約占基因組的2／3。這些基因編碼的蛋白被木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（papain?like cysteine protease，PLpro）和 3C 樣絲氨酸蛋白酶（3C?like serine protease，3CLpro）裂解，產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA 依賴性RNA 聚合酶（RNA?dependent RNA polymerase，RdRp）和解旋酶（helicase，Hel），它們是參與冠狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的重要酶?；蚪M的 3′端編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M 和 N 蛋白）和8 種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b 和 OFR14 蛋白）［9］，見圖1。結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于病毒-細(xì)胞受體結(jié)合和病毒體裝配至關(guān)重要，輔助蛋白除了參與病毒結(jié)構(gòu)的組裝外還可能具有免疫調(diào)節(jié)作用。SARS?CoV?2 的基因組與蝙蝠 SARS?like?CoVZXC21 具有 89%的核苷酸同源性，與人類SARS?CoV 具有82%的核苷酸同源性。它們之間的主要區(qū)別是在基因ORF3b、S 和 ORF8 中，尤其是 S1 和 ORF8［10］。

圖1 冠狀病毒結(jié)構(gòu)示意圖［9］Fig.1 Schematic representation of the coronavirus structure［9］

2 抗SARS?CoV?2藥物的篩選

COVID?19 是歷史上第3 次由冠狀病毒引起的嚴(yán)重的重癥呼吸道感染類疾病，相比于2003年暴發(fā)的SARS 和2012年暴發(fā)的MERS，在抗病毒藥物篩選方面有了更多的經(jīng)驗(yàn)可以參考，但也面臨著新的挑戰(zhàn)。目前，有4 種潛在的抗病毒藥物篩選途徑［11］。

2.1 從現(xiàn)有廣譜抗病毒藥物中篩選抗SARS?CoV?2藥物

這些藥物已用于治療其他病毒感染，藥效和副作用明確，生產(chǎn)和供應(yīng)充足，是快速應(yīng)對(duì)疫情的首選藥物。例如洛匹那韋／利托那韋是一種固定劑量的蛋白酶抑制劑（protease inhibitor，PI）組合，原本用于治療 HIV?1 感染［12］，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì) SARS［13］和 MERS［14］均有明顯治療效果，目前正在用于COVID?19 的治療［15］；利巴韋林是一種合成的核苷類似物，在結(jié)構(gòu)上類似于鳥苷，具有廣泛的抗病毒活性，通常將其與α-干擾素或聚乙二醇化的α-干擾素聯(lián)合起來(lái)用于治療慢性丙型肝炎病毒感染［16］，目前該方案同樣被用于 COVID?19 的治療［15］；磷酸氯喹是一種用于治療瘧疾的老藥，在中國(guó)進(jìn)行的多中心臨床試驗(yàn)中顯示出對(duì)COVID?19 的明顯療效和可接受的安全性，目前已被納入《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》［15，17］；Arbidol（umifenovir）是在俄羅斯和中國(guó)批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療流感的廣譜抗病毒化合物。除了用于治療流行性感冒，Arbidol在體外研究中顯示對(duì)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、基孔肯雅病毒、呼腸孤病毒、漢坦病毒和柯薩奇病毒B5 具有抑制活性，目前該藥物也被列入《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》［15，18］；復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院應(yīng)天雷、武延亮和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院楊振林等教授合作，首次發(fā)現(xiàn)SARS 冠狀病毒特異性的人類單克隆抗體 CR3022 可以有效結(jié)合SARS?CoV?2 的受體結(jié)合域 RBD［19］。

2.2 從傳統(tǒng)中藥復(fù)方中篩選抗SARS?CoV?2藥物

多種傳統(tǒng)中藥活性成分可通過(guò)降低機(jī)體炎癥因子表達(dá)、抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴、減少氧化應(yīng)激-自由基堆積和細(xì)胞凋亡、改善機(jī)體免疫功能等途徑發(fā)揮抗病毒功效［20］。疫情發(fā)生以來(lái)尚未發(fā)現(xiàn)特異性的抗病毒藥物，但在醫(yī)生和科學(xué)家們的共同努力下，很多患者都成功治愈，中藥復(fù)方在COVID?19 的治療中發(fā)揮了重要的作用［21］。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)出通知，推薦在中西醫(yī)結(jié)合救治 COVID?19 患者中使用“清肺排毒湯”。該方經(jīng)國(guó)內(nèi)幾個(gè)省份推廣應(yīng)用，初步總結(jié)，總有效率達(dá)到90%以上［22］。另外，呂睿冰等［23］發(fā)現(xiàn)中藥連花清瘟明顯改善了COVID?19 疑似病例發(fā)熱、咳嗽、乏力、氣促等癥狀，并降低轉(zhuǎn)重癥比例。但由于中藥成分復(fù)雜，具體的抗病毒機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.3 從其他藥物和化合物文庫(kù)篩選抗SARS?CoV?2藥物

通過(guò)藥物和化合物文庫(kù)可以快速高通量地進(jìn)行抗病毒藥物初步篩選，再結(jié)合抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)估藥效。如由蔣華良院士和饒子和院士牽頭，20 余個(gè)課題組參與的中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所和上海科技大學(xué)免疫化學(xué)研究所抗SARS?CoV?2病毒感染聯(lián)合應(yīng)急攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，利用虛擬篩選和酶學(xué)測(cè)試相結(jié)合的策略，針對(duì)已上市藥物以及自建的“高成藥性化合物數(shù)據(jù)庫(kù)”和“藥用植物來(lái)源化合物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”進(jìn)行了藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了30 種可能對(duì)SARS?CoV?2 有治療作用的化學(xué)藥物、天然活性產(chǎn)物和傳統(tǒng)中藥［24］。北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的王月丹和初明團(tuán)隊(duì)，采用自主研發(fā)的人工智能藥物靶向篩選系統(tǒng)，針對(duì)2 674 種已上市的藥物以及1 500 種中藥提取物進(jìn)行了藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了多種潛在的ACE2 結(jié)合劑。所有這些探索，有望及早用于SARS?CoV?2 病毒感染的治療［25］。這種方法的缺點(diǎn)是：盡管許多已鑒定的藥物在體外均表現(xiàn)出抗冠狀病毒活性，但大多數(shù)藥物并不能應(yīng)用于臨床，因?yàn)樗鼈円淳哂忻庖咭种谱饔茫窗霐?shù)效應(yīng)濃度（EC50）明顯超過(guò)在治療劑量下可達(dá)到的峰值血清濃度（Cmax）［11］。

2.4 根據(jù)SARS?CoV?2的特征設(shè)計(jì)新型靶向藥物

可以根據(jù)SARS?CoV?2 的蛋白結(jié)構(gòu)特異性，研發(fā)特異的疫苗或抗體；根據(jù)SARS?CoV?2 的基因組序列特異性，設(shè)計(jì)靶向病毒復(fù)制周期中關(guān)鍵酶或者關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的 siRNA 干擾分子；根據(jù) SARS?CoV?2 感染宿主細(xì)胞所依賴的特異性受體，開發(fā)靶向宿主受體的mAb 或抗病毒肽；根據(jù) SARS?CoV?2 被宿主細(xì)胞內(nèi)吞及在宿主細(xì)胞中復(fù)制所依賴的特定蛋白酶，開發(fā)相應(yīng)的蛋白酶抑制劑等［11］。這類方法設(shè)計(jì)的新藥具有高度的特異性，且藥物設(shè)計(jì)比較靈活。但問(wèn)題在于，雖然這些藥物中的大多數(shù)在體外和（或）體內(nèi)具有較高的抗病毒活性，但它們的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效特性以及副作用等情況尚需在動(dòng)物和人體試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，從研發(fā)到臨床應(yīng)用有一個(gè)過(guò)程，很難用于病毒的突發(fā)性感染。盡管如此，針對(duì) SARS?CoV?2 的疫苗和新藥研發(fā)依舊刻不容緩，尤其在當(dāng)前對(duì)病毒來(lái)源及傳播途徑尚不明確的情況下，病毒與人類長(zhǎng)期共存及在特定環(huán)境下再次暴發(fā)都是可能的風(fēng)險(xiǎn)。疫苗和新藥的研發(fā)，將有助于人類對(duì)SARS?CoV?2 及類似病毒感染的預(yù)防和治療。

3 RNAi技術(shù)

RNAi 廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是生物進(jìn)化過(guò)程中為了對(duì)抗外源病毒的侵犯、維護(hù)細(xì)胞正常發(fā)育所形成的一種保護(hù)機(jī)制，是小RNA 分子靶向特異性mRNA 并使其降解以抑制特定基因表達(dá)的過(guò)程（圖2）［26］。雙鏈 RNA（double strand RNA，dsRNA）進(jìn)入細(xì)胞后，一方面與RNA 核酸酶相結(jié)合，被酶切成很多被稱為小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）的小片段，這一過(guò)程被稱為干擾的啟動(dòng)階段；另一方面是和TRBP、Dicer 和Ago2 等蛋白形成多聚核酸酶復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合于與siRNA 互補(bǔ)的mRNA 上，執(zhí)行RNAi 的效應(yīng)功能。與此同時(shí)，多聚核酸酶復(fù)合物以siRNA 作為引物、mRNA 作為模板，在 RNA 聚合酶的作用下自身擴(kuò)增，再重復(fù)以上被酶切的過(guò)程。新生成的siRNA 同樣具有誘發(fā)RNAi 的作用，通過(guò)這種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)siRNA 大量增加，可顯著抑制基因的表達(dá)。由于RNAi 技術(shù)投入少、周期短、操作簡(jiǎn)單，幾乎成為一種標(biāo)準(zhǔn)化分子生物學(xué)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因治療和基因功能研究等領(lǐng)域［27］。與其他治療方法相比，RNAi 技術(shù)能夠高效、特異地下調(diào)靶基因的表達(dá)水平，這能有效降低或消除患者的不良反應(yīng)、延長(zhǎng)治療效果、降低治療成本，是一種十分有前景的疾病治療方法［28?29］。目前，多家公司利用 RNAi的治療潛力來(lái)研發(fā)新型治療藥物。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)了2 款基于RNAi 技術(shù)研發(fā)的基因治療藥物：Givlaari（Givosiran sodium）和Onpattro（Patisiran sodium）。前者于 2019年 11月被批準(zhǔn)用于治療急性肝卟啉癥，后者于2018年8月被批準(zhǔn)用于遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性［30?31］。

圖2 siRNA 介導(dǎo)的 RNAi 干擾機(jī)制圖［26］Fig.2 Schematic mechanism representation of the siRNA?mediated RNAi technique［26］

4 RNAi技術(shù)防治SARS?CoV?2的展望

抗病毒RNAi 的生物防御機(jī)制在植物和無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)揮著重要的作用，在哺乳動(dòng)物中非序列特異性的干擾素反應(yīng)可能已取代了天然抗病毒RNAi的功能［32?33］。越來(lái)越多的研究表明，哺乳動(dòng)物中病毒容易受到人工合成的siRNA 的影響［34］，這使通過(guò)人工合成siRNA 重激活哺乳動(dòng)物的天然抗病毒RNAi 的功能進(jìn)行抗病毒治療成為可能。目前已有許多應(yīng)用RNAi 技術(shù)進(jìn)行抗病毒治療的相關(guān)研究。

SARS?CoV?2 的 S 蛋白是識(shí)別宿主細(xì)胞受體和感染特定細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)。SARS?CoV?2 正是通過(guò)S 蛋白識(shí)別人肺上皮細(xì)胞 ACE2 蛋白［35］，結(jié)合到受體細(xì)胞，進(jìn)而侵染細(xì)胞，因此不論采用什么手段，阻斷病毒S 蛋白與人肺上皮細(xì)胞ACE2 蛋白的結(jié)合，都是抑制 SARS?CoV?2 擴(kuò)散感染的有效途徑。有研究顯示，針對(duì)SARS?CoV 的S 基因設(shè)計(jì)的干擾RNA在細(xì)胞水平和恒河猴體內(nèi)都顯示出良好的抗病毒效果［36?38］。除 S 蛋白外，E 蛋白、M 蛋白和 N 蛋白也是冠狀病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)于病毒顆粒的包裝至關(guān)重要。之前也有人針對(duì)SARS?CoV 的E 基因、M 基因以及N 基因設(shè)計(jì)了特異性的干擾RNA，并開發(fā)了表達(dá)短發(fā)夾RNA 分子的重組腺病毒載體，在細(xì)胞水平有效抑制了SARS?CoV 的基因復(fù)制和新病毒產(chǎn)生［39］。冠狀病毒的輔助蛋白除參與病毒組裝外還可能具有抑制宿主免疫反應(yīng)以促進(jìn)病毒復(fù)制等功能。例如，MERS?CoV 的輔助蛋白 4a、4b 和輔助蛋白5 表現(xiàn)出干擾素拮抗劑活性。盡管尚不能確定SARS?CoV?2 所有輔助蛋白的具體生物學(xué)功能，但這并不影響 RNAi 技術(shù)的應(yīng)用。RNAi 可以從RNA 序列層面，對(duì)病毒RNA 進(jìn)行特異性識(shí)別及降解，從根源上“剪切”病毒，達(dá)到消滅病毒的效果。在其他病毒已經(jīng)有成功的報(bào)道，比如，針對(duì)SARS?CoV 的 ORF3a／3b、ORF7a／7b 和 ORF8a／8b 基因設(shè)計(jì)干擾 RNA，能有效降低輔助蛋白 3a／3b 或 7a／7b 和8a／8b 的表達(dá)，抑制 Vero E6 細(xì)胞中 SARS?CoV 的復(fù)制［40］。

RNAi 技術(shù)在臨床應(yīng)用方面也存在一些問(wèn)題。首先是siRNA 的遞送問(wèn)題，涉及siRNA 感染效率，細(xì)胞或者病毒本身具有對(duì)外源基因的防御機(jī)制，因此必須提高siRNA 感染效率以達(dá)到治療效果。其次是針對(duì)病毒基因組容易突變的特點(diǎn)，需要靈活設(shè)計(jì)siRNA 序列或者應(yīng)用siRNA 組合，同時(shí)確保最低限度的脫靶效應(yīng)。隨著各種基因修飾、基因治療的興起，越來(lái)越多的材料學(xué)家們投身于相關(guān)遞送材料的研究，為siRNA 在人體內(nèi)高效、安全、靶向性的遞送提供了可能［41］。雖然 RNA 病毒易發(fā)生突變，但正如前文所述，SARS?CoV?2 基因組中也存在許多保守的基因序列可以作為藥物的穩(wěn)定靶點(diǎn)，另外siRNA 合成方便，可以靈活應(yīng)對(duì)病毒突變所產(chǎn)生的耐藥性［42］。對(duì)于 siRNA 的脫靶問(wèn)題，除了優(yōu)化siRNA 設(shè)計(jì)外，提高藥物遞送的局部靶向性也是很好的解決方案［43］。

COVID?19 疫情暴發(fā)以來(lái)，雖然傳統(tǒng)的抗病毒藥物例如干擾素、洛匹那韋／利托那韋、利巴韋林及中藥等顯示了一定的療效，但仍有不少重癥患者因缺乏特異性有效藥物而失去生命。目前科學(xué)家們正在努力研發(fā)特異性疫苗及中藥、小分子化合物等抗病毒藥物。RNAi 作為一種天然的抗病毒機(jī)制，其針對(duì)COVID?19 特異序列的研究已經(jīng)啟動(dòng)，有望為COVID?19 的治療帶來(lái)新的曙光。