倪 萍，劉月琴，李 旺，蘇兆亮，周成林*

（1.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300； 2.江蘇大學免疫學研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學第四附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

乳腺癌是威脅女性身心健康的一種常見惡性腫瘤，目前關于乳腺癌的發(fā)病機制及病因尚未明確闡述。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，其參與了腫瘤細胞的生殖、分化過程；而MDSC具有顯著的抑制免疫細胞應答的能力[1]。研究表明，乳腺癌患者中HMGB1表達情況與MDSC具有一定關聯(lián)性，但目前相關報道相對較少[2]。鑒于此，本研究主要分析乳腺癌中HMGB1表達與MDSC的相關性，旨在指導臨床預測乳腺癌的發(fā)生風險。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光定量P C R 試劑盒（大連寶生）；H M G B 1抗體（Abcam）、GAPDH抗體（南京凱基）；PCR引物（廣州復能）；PE-anti-CD11b抗體、FITC-anti-Gr-1抗體（BD）。 BALB/C裸鼠，揚州大學動物中心購得。人乳腺癌MCF-7細胞系來自本研究室。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤鼠模型的建立

BALB/C裸鼠肩胛區(qū)皮下注射MCF-7 106-107細胞0.3 mL，2周后取腫瘤組織、脾臟和外周血。

1.2.2 流式細胞儀

將1×106細胞加入25 μLPBS中，分別加FITC標記的Gr-1抗體1 μL和PE標記的CD11b抗體2.5 μL，冰上孵育30 min，然后加入1 mL PBS，離心，重復2次。最后加200 μL PBS懸浮細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.3 Western blot

10 g/L PMSF的裂解液制備總蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；PVDF轉膜，脫脂奶粉封閉；HMGB1抗體（1：1000）4°C孵育過夜。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（1：5000）孵育2 h，ECL法顯色，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)來檢測蛋白條帶。

1.2.4 RT-qPCR

提取總RNA后逆轉錄成cDNA，RT-qPCR檢測HMGB1表達，GAPDH作為內參照。25 μL體系，擴增條件為：95°C預變性15秒，95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸15秒，共40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

Graphpad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組比較采用Student’s t檢驗，Pearson分析相關性，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MDSC的檢測

荷瘤鼠脾臟和外周血中MDSC的比例高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（***為p＜0.001）,見圖1。

2.2 癌組織中HMGB1水平

HMGB1蛋白水平（圖2A）、mRNA，差異有統(tǒng)計學意義（圖2B，P＜0.05）在癌組織中高表達。

2.3 癌組織中HMGB1和MDSC的相關性

相關性分析發(fā)現(xiàn)HMGB1和MDSC之間呈現(xiàn)正相關關系,見圖3。

3 討 論

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，其可通過損傷、壞死的細胞釋放至胞外，或者通過活化后的細胞釋放至胞外。已有文獻報道HMGB1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關；因此有望成為腫瘤治療的新方向。MDSC是一種異質性細胞群體，其在感染、免疫抑制等病理中會阻礙MDSC分化成成熟細胞，致使其大量聚集在脾臟、外周血、病變部位等[3]，進而抑制機體免疫應答，促進腫瘤細胞生長、增殖。細胞核外的HMGB1促進趨化因子釋放，還可誘導IL-6、TNF-α等炎性因子，導致MDSC積聚，進而加重機體免疫抑制反應，由此推測，HMGB1可能是調控MDSC的一個促炎因子[4]。此外，HMGB1可與MDSC表面上的RAGE受體與TLR-4受體結合，并通過NF-kB、P38MAPK、ERK1/2信號通路來調控MDSC分化，致使MDSC積聚，進而加強對T細胞、NK細胞的抑制作用，加重機體免疫應答抑制，促進腫瘤細胞增殖、生長，進而促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結果顯示，荷瘤鼠癌組織中HMGB1表達高于癌旁組織，荷瘤鼠脾臟和外周血中MDSC的比例也高于正常對照組，且HMGB1高表達與MDSC比例增加之間呈正相關。因此，我們推測可能是HMGB1調控MDSC的作用參與乳腺癌發(fā)生，但是乳腺癌中HMGB1是如何具體調控MDSC的以及具體的分子機制仍待證實。

綜上所述，HMGB1在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達且與MDSC的關系呈正相關，但是在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中HMGB1是如何調控MDSC分化的仍需研究。為以后乳腺癌的治療提供新的作用靶點。