王 瀟，王 婷，成顏芬，何 單，劉 芳，傅超美

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137）

厚樸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效［1-3］，其主要成分為木脂素、生物堿、揮發(fā)油等，具有緩解胃腸運(yùn)動(dòng)障礙、抗抑郁、抗菌、抗炎等藥理作用［4］，常與其他藥物合用，臨床使用廣泛，如《傷寒雜病論》 中的小承氣湯、半夏厚樸湯等［4］。厚樸傳統(tǒng)入藥形式為水煎液，隨著對(duì)其研究的不斷深入，提取方式也日益完善，在2015 年版《中國(guó)藥典》 中，有9 種中成藥都是以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取，在一定程度上提高了其有效成分提取率，但厚樸酚、和厚樸酚等主要有效成分難溶于水，其口服生物利用度仍然較低，從而限制了相關(guān)制劑開發(fā)，影響了臨床應(yīng)用［5-6］。

針對(duì)藥物難溶性的問題，目前大多制備微乳、納米粒、脂質(zhì)體、固體分散體等劑型加以改善［7-8］，同時(shí)，中藥提取物多成分同時(shí)增溶是制劑領(lǐng)域的一大難題，將提取物制成固體分散體［9］后可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。前期報(bào)道，將厚樸酚、和厚樸酚、厚樸總酚制成固體分散體［10-12］可提高厚樸主要有效成分溶解性。本實(shí)驗(yàn)制備厚樸乙醇提取物固體分散體［13］，通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其制備工藝，并進(jìn)行體外表征，以期解決提取物多成分同時(shí)增溶的難題，為相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆籞DHW 調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DZF-6050 臺(tái)式真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；UPK-I-107 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津制作所）；電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；UV756CRT 紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試劑與藥物 厚樸采自四川省都江堰虹口鎮(zhèn)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本中心連艷老師鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils。厚樸酚（批號(hào)A0316AS，純度＞98%）、和厚樸酚（批號(hào)S0318AS，純度＞98%）對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。聚乙二醇6000（PEG6000）、羥丙基甲基纖維素（HPMC）（成都科龍化工試劑廠）；泊洛沙姆188（F68，德國(guó)BASF 公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，天津市歐博凱化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備 根據(jù)課題組前期所得最佳提取工藝，飲片粉碎成粗粉，稱取約1 kg，8 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h，合并提取液，50 ℃下減壓濃縮至無醇味，提取液冷凍干燥，粉碎，即得。

2.2 厚樸酚、和厚樸酚含有量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品10.10、10.72 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后稀釋至刻度，各取25 mL 于50 mL 量瓶中混合，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取提取物約100 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 參考2015 年版《中國(guó)藥典》，分析采用Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1% 磷酸（78∶22）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 mL，甲醇倍比稀釋至厚樸酚質(zhì)量濃度分別為3.16、6.31、12.63、25.25、50.50、101.00 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為3.35、6.70、13.40、26.80、53.60、107.20 μg/mL，搖勻，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為厚樸酚Y=15 915 320X+33 591（r=0.999 5），線性范圍3.16～101.00 μg/mL；和厚樸酚Y=16 793 512X+47 215（r=0.999 1），線性范圍3.35～107.20 μg/mL。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚峰面積RSD 分別為0.28%、0.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、3、6、12、24、48 h 在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚峰面積RSD 分別為0.42%、0.34%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取提取物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚、和厚樸酚含有量RSD 分別為1.32%、1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份含有量已知的提取物，精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚平均加樣回收率分別為98.47%（RSD=1.92%），99.69%（RSD=2.31%）。

2.2.5 測(cè)定結(jié)果 厚樸酚、和厚樸酚平均含有量（n=3）分別為（18.54 ± 0.18）%、（10.53 ±0.79）%。

2.3 固體分散體制備［5］采用溶劑法、PEG6000-F68 聯(lián)合載體制備，溶出介質(zhì)為人工腸液。取厚樸提取物適量，與載體按一定比例混合均勻后用適量乙醇溶解，置于磁力攪拌器上攪拌適當(dāng)時(shí)間，旋蒸除去乙醇后置于真空干燥箱中24 h，取出，粉碎，過40 目篩，即得，置于干燥器中備用。

2.4 體外溶出度測(cè)定 將約含1 g 厚樸提取物的固體分散體直接投入溶出杯中，按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部通則0931 第二法（槳法）［3］測(cè)定溶出度，溶出介質(zhì)900 mL 人工腸液，轉(zhuǎn)速50 r/min，溶出液溫度（37±0.5）℃。分別于5、10、15、20、30、45、60、120 min 各取5 mL，補(bǔ)加同溫同體積溶出介質(zhì)，取出液加同體積甲醇，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚總?cè)艹雎?，繪制溶出度曲線。

2.5 工藝考察

2.5.1 制備方法 固定藥載比為1∶5，載體為F68，分別采用下列方法制備。（1）溶劑法，同“2.3”項(xiàng)；（2）熔融法，將載體置于蒸發(fā)皿中，70 ℃水浴鍋上使其熔融后加入適量厚樸提取物，水浴鍋上繼續(xù)攪拌均勻，室溫下冷卻變脆后粉碎；（3）溶劑-熔融法，將載體置于蒸發(fā)皿中，70 ℃水浴鍋上使其熔融后加入適量乙醇溶解的厚樸提取物，攪拌除去乙醇，室溫下冷卻，置于真空干燥箱中干燥后粉碎；（4）研磨法，將厚樸提取物和載體置于研缽中，用力研磨至顏色均勻，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定上述固體分散體溶出度，結(jié)果見圖2A，由此可知，120 min 內(nèi)累積溶出度依次為溶劑法＞熔融法＞溶劑-熔融法＞研磨法，故選擇溶劑法進(jìn)行制備［14］。

圖2 制備方法、溶出介質(zhì)、載體種類對(duì)總?cè)艹龆鹊挠绊慒ig.2 Effects of preparation method，dissolution medium and carrier kind on total dissolution rate

2.5.2 溶出介質(zhì) 固定藥載比為1∶5，載體為F68，按“2.3”項(xiàng)下方法制備固體分散體，按“2.4”項(xiàng)下方法分別測(cè)定其在人工胃液、人工腸液、純水中的溶出度，結(jié)果見圖2B。由此可知，120 min 內(nèi)累積溶出度依次為人工腸液＞純水＞人工胃液，故選擇人工腸液作為溶出介質(zhì)。

2.5.3 載體種類 固定藥載比為1∶5，選擇PEG6000、F68、HPMC、PVP K30 作為載體，按“2.3”項(xiàng)下方法制備固體分散體，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定溶出度，結(jié)果見圖2C。由此可知，120 min內(nèi)累積溶出度依次為PEG6000 大于F68 大于PVP K30 大于HPMC，故選擇PEG6000-F68（1∶1）作為載體，并可避免單一載體造成的老化問題［15］。

2.6 單因素試驗(yàn) 考察了載體（PEG6000-F68）比、藥載比、攪拌時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)，考察四者對(duì)60 min 內(nèi)厚樸酚、和厚樸酚總?cè)艹龆鹊挠绊?，結(jié)果見圖3。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)總?cè)艹龆茸罡撸使潭ㄈ軇?0% 乙醇，不作后續(xù)優(yōu)化。

圖3 載體比、藥載比、攪拌時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)艹龆鹊挠绊慒ig.3 Effects of carrier ratio，drug-carrier ratio，stirring time and ethanol concentration on total dissolution rate

2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇載體比（A）、藥載比（B）、攪拌時(shí)間（C）作為影響因素，總?cè)艹龆龋╕）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化制備工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

通過Design-Expert 10.0.7 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到擬合回歸方程為Y=96.89-4.10A+4.46B-2.94C-7.41AB+0.52AC-0.21BC-9.51A2-17.17B2-14.57C2，方差分析見表3。由表可知，模型P＜0.01，表明其極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度良好；一次項(xiàng)中，A、B均為顯著項(xiàng)（P＜0.05），C為不顯著項(xiàng)（P＞0.05），程度依次為B＞A＞C；二次項(xiàng)中，A2、B2、C2均有顯著影響（P＜0.05）；交互項(xiàng)中，AB為顯著項(xiàng)（P＜0.05），AC、BC均為不顯著項(xiàng)（P＞0.05）；調(diào)整系數(shù)為0.914 3，即能解釋91.43%響應(yīng)值的變化，表明模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小。響應(yīng)面分析見圖4。

由此可知，最優(yōu)制備工藝為載體比0.885∶1，藥載比1∶5.388，攪拌時(shí)間116.775 min，考慮到實(shí)際可操作性，將其修正為載體比0.9∶1，藥載比1∶5.4，攪拌時(shí)間115 min。按該優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均溶出度為97.12%，RSD為1.77%，與預(yù)測(cè)值98.08%接近，表明模型穩(wěn)定可靠，工藝合理可行。

圖4 各因素響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

2.8 體外表征

2.8.1 體外溶出度 精密稱取厚樸提取物、厚樸物理混合物、厚樸固體分散體適量，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定總?cè)艹龆?，結(jié)果見圖5，可知厚樸固體分散體能提高有效成分溶出度。

2.8.2 掃描電鏡（SEM）圖6 顯示，提取物呈塊狀物，表面光滑或有細(xì)密小孔；載體為顆粒形，表面有明顯孔隙；藥物-載體物理混合物可見藥物塊狀物，載體顆粒物更小，顆粒劑也有孔隙存在；固體分散體呈無定形態(tài)，完全看不到孔隙，推測(cè)藥物可能已高度分散于載體中，表明制備成功。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖5 厚樸各樣品溶出曲線Fig.5 Dissolution curves for various samples of M.officinalis

圖6 厚樸各樣品SEM 圖Fig.6 SEM images for various samples of M.officinalis

2.8.3 差示量熱掃描（DSC）以空鋁坩為參考池，另一空鋁坩為樣品池，放入約10 mg 樣品，掃描速度10 ℃/min，掃描范圍35～200 ℃，結(jié)果見圖7。由此可知，提取物在60 ℃左右有明顯吸熱峰；載體在40～50 ℃有2 個(gè)吸熱峰，吸熱峰較大；藥物-載體物理混合物在40～50 ℃也有2 個(gè)吸熱峰，但均較小；固體分散體吸熱峰消失，表明其以無定型狀態(tài)存在，并且制備成功。

圖7 厚樸各樣品DSC 圖Fig.7 DSC diagrams for various samples of M.officinalis

2.8.4 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）KBr 壓片，掃描范圍4 000～400 cm-1，結(jié)果見圖8。由此可知，提取物在3 381 cm-1有1 個(gè)強(qiáng)而寬的吸收峰，表明有-OH 存在；載體僅在3 485 cm-1處有1個(gè)小吸收峰，與提取物明顯不同；藥物-載體物理混合物中同時(shí)具有藥物、載體特征吸收峰，表明兩者之間未形成新化合鍵；固體分散體在3 416 cm-1處形成了1 個(gè)新吸收峰，表明在制備過程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，可能藥物中-OH 在載體材料中形成分子內(nèi)氫鍵，從而對(duì)其吸收峰位置、形狀、強(qiáng)度均產(chǎn)生一定影響。

圖8 厚樸各樣品FT-IR 圖譜Fig.8 FT-IR spectra for various samples of M.officinalis

3 討論

厚樸乙醇提取物組成復(fù)雜，含有木脂素（如厚樸酚、和厚樸酚）、生物堿（如木蘭花堿）等成分，以厚樸酚、和厚樸酚為主，但兩者水溶性差，體外溶出度低［16］，故本實(shí)驗(yàn)以其總?cè)艹龆葹樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化［17］制備工藝，并進(jìn)行體外表征。結(jié)果表明，工藝穩(wěn)定可行。

在用PEG 6000、F68、HPMC、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）等幾種水溶性材料制備固體分散體時(shí)，載體強(qiáng)大的增溶效果，可使藥物處于過飽和狀態(tài)，并且后者在載體中的分散度大大提高［13］，使其以分子形式不規(guī)則地分散在載體中，從而形成無定形固體分散體［18-20］。本實(shí)驗(yàn)選擇PEG 6000、F68聯(lián)合載體，有利于同時(shí)增加厚樸乙醇提取物多成分溶出度，提高其生物利用度。

固體分散體在儲(chǔ)存過程中，環(huán)境中的水分會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與藥物或載體結(jié)合，破壞藥物與載體之間的氫鍵相互作用，出現(xiàn)不穩(wěn)定這一“老化”問題［21］。今后，將針對(duì)厚樸乙醇提取物固體分散體的穩(wěn)定性、生物利用度進(jìn)行深入研究。