何 艷，胡小祥

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖南 郴州 423000）

小兒解表顆粒為兒科常用方劑，由金銀花、連翹、炒牛蒡子、蒲公英、黃芩、防風(fēng)、紫蘇葉、荊芥穗、葛根、人工牛黃10 味藥材組成，具有宣肺解表、清熱解毒的作用，用于小兒外感風(fēng)熱所致的感冒，癥見發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛咳嗽，鼻塞流涕、咽喉痛癢［1］。方中連翹辛涼解表、清熱解毒，為君藥，主要活性成分為連翹苷、連翹酯苷A［2］；牛蒡子功效解風(fēng)熱之邪、利咽止痛、辛涼解表、清熱解毒，其主要有效活性成分為牛蒡苷［3-4］，而黃芩清熱解毒，主要活性成分有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等［5］，兩者皆為臣藥；葛根性甘、涼，解肌退熱，為佐藥，其主要活性成分為葛根素［6］。

在2015 年版《中國藥典》 小兒解表顆粒項(xiàng)下，僅以黃芩苷為定量測定成分，指標(biāo)單一，不利于整體質(zhì)量控制；文獻(xiàn)［7-11］中，該制劑都以1～3 種成分含有量為指標(biāo)進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時測定小兒解表顆粒中葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、漢黃芩苷、牛蒡苷、黃芩素的含有量，涵蓋了方中君藥、臣藥、佐藥，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G1311B 四元泵、G1329B 自動進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D DAD 檢測器（美國Agilent 公司）；XSE-205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 葛根素（批號110752-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%）、連翹酯苷A（批號111810-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 93.4%）、黃芩苷（批號110715-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）、牛蒡苷（批號110819-201611，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.9%）、漢黃芩苷（批號112002-201702，質(zhì)量分 數(shù)95.9%）、黃芩素（批號111595-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。小兒解表顆粒（批號171119，四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司；批號 ZGA1703、ZCA1805、ZBA1804、ZGA1701、ZCA1710，云南白藥集團(tuán)股份有限公司）。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；磷酸、甲醇為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，8%～20%A；15～25 min，20%～35%A；25～30 min，35%～40%A；30～35 min，40%A；35～35.1 min，40%～8% A；35.1～ 40 min，8% A）；體積流 量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長0～13 min 時250 nm，13～22 min 時326 nm，22～40 min 時278 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品葛根素10.60 mg、連翹酯苷A 10.89 mg、牛蒡苷10.13 mg、漢黃芩苷9.28 mg、黃芩素5.76 mg，置于50 mL量瓶中，70% 甲醇溶解并稀釋至刻度。精密稱取3.39 mg 黃芩苷對照品至25 mL 量瓶中，再分別精密吸取上述5 種溶液3、6、8、4、2 mL 置于其中，振搖，70% 甲醇定容，搖勻，即得（含葛根素24.26 μg/mL、連翹酯苷A 48.82 μg/mL、黃芩苷126.8 μg/mL、牛蒡苷62.17 μg/mL、漢黃芩苷29.25 μg/mL、黃芩素9.077 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，取粉末約0.8 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W、40 kHz）30 min，放冷，70% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按顆粒處方工藝，分別制備缺葛根、連翹、黃芩、炒牛蒡子的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性樣品溶液在與對照品溶液相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)；各成分分離效果理想，分離度均大于1.5，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積 RSD 分別為1.3%、0.23%、0.22%、0.21%、0.27%、0.52%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號ZGA1703），分別于0、2、6、12、18、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為1.2%、1.7%、0.55%、0.25%、0.37%、2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品（批號ZGA1703）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素含有量RSD 分別為1.1%、0.55%、0.63、1.4%、0.82%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一份顆粒（批號ZGA1703），研細(xì)，稱取粉末約0.4 g，共6 份，精密加入50 mL 含葛根素8.288 μg/mL、連翹酯苷A 3.654 μg/mL、黃芩苷42.64 μg/mL、牛蒡苷22.73 μg/mL、漢黃芩苷9.141 μg/mL、黃芩素2.618 μg/mL 的70% 甲醇溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，計(jì)算回收率。測得葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素平均加樣回收率分別為 98.8%、101.0%、100.0%、99.4%、98.9%、101.4%，RSD 分別為1.6%、1.3%、1.2%、0.74%、0.58%、1.2%。

2.9 樣品含有量測定 取6 批顆粒，每批3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 成分選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了小兒解表顆粒另一君藥金銀花中綠原酸，通過查閱文獻(xiàn)［12-13］和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它在牛蒡子、蒲公英中也能檢出，不具有專屬性，故未納入分析；連翹中連翹苷含有量低，均勻性差，故選擇另一指標(biāo)性成分連翹酯苷A進(jìn)行測定。

3.2 檢測波長選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測器在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，并采集光譜圖。結(jié)果，葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素分別在250、326、278、278、276、276 nm 處有最大吸收，故選擇250 nm作為葛根素檢測波長，326 nm 作為連翹酯苷A 檢測波長，278 nm 作為黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素檢測波長。

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Waters Symmetry-C18、Thermo Hypersil Gold-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)Waters Symmetry-C18色譜柱分離效果最好，色譜峰對稱性理想。再考察了流動相乙腈-水、乙腈-0.1% 乙 酸、乙 腈-0.1% 磷 酸、乙 腈-0.2% 磷酸［14-15］，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2% 磷酸洗脫時各成分分離度、色譜峰對稱性良好。最終，確定為“2.1”項(xiàng)下色譜條件。

3.4 含有量分析 表3 顯示，6 批小兒解表顆粒樣品中各成分含有量差異較大，除了不同生產(chǎn)企業(yè)之間（如連翹酯苷A 相差近6 倍）外，同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次之間也是如此，如黃芩素相差近3倍。其原因可能是不同批次原料藥差異所致，需引起廠家關(guān)注。