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（1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；3.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230031；4.亳州學院，安徽 亳州 236800）

十三味和中丸是由安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院研制的特色院內制劑，由柴胡、枳殼、延胡索、炒白芍、陳皮、酒黃連、酒黃芩、川楝子、姜半夏、吳茱萸、茯苓、砂仁、甘草13 味藥材組成，具有疏肝理氣、和胃止痛之功效［1］，主要用于治療胃脘脹痛、嘈雜、噯氣等癥，臨床應用二十多年，療效顯著。但該方藥味較多，組成復雜，單一成分分析很難全面反映其特征，而且不同成分吸收波長也有很大差異，目前尚無完整的質量評價體系［2-3］。

多波長HPLC 法測定復雜體系含有量已有很多相關報道［4-6］，目前主要依據(jù)復方中君臣佐使關系選擇君藥或臣藥，或成方中用量較大的藥材、特殊用藥作為考察指標［7］，并依據(jù)2015 年版《中國藥典》 一部選擇具體藥材的指標成分。本實驗在此基礎上，建立HPLC 法同時測定十三味和中丸中芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 的含有量，以期提供多指標評價該制劑質量的方法。

1 材料

1.1 儀器 U-3000 高效液相色譜儀（配置DAD檢測器）、FB15065 超聲波清洗器（美國Thermo 公司）；XPE-205 電子分析天平（0.001 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試劑與藥物 十三味和中丸（批號20170616、20170915、20171214、20180318、20180615，編號SSW1～SSW5，每10 丸重1.5 g）購于安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室。芍藥苷（批號110736-201640，質量分數(shù)95.20%）、延胡索乙素（批號110726-201011，質量分數(shù)99.90%）、鹽酸小檗堿（批號110713-201212，質量分數(shù)86.70%）、柚皮苷（批號110722-201714，質量分數(shù)94.30%）、橙皮苷（批號110721-201316，質量分數(shù)95.30%）、黃芩苷（批號110715-201318，質量分數(shù)93.30%）、甘草酸 銨（批號110731-201418，質量分 數(shù)93.10%）、柴胡皂苷a（批號110777-201309，質量分數(shù)92.00%）、柴胡皂苷d（批號110778-201409，質量分數(shù)96.00%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，購于美國Tedia 公司；磷酸為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水［屈臣氏集團（香港）有限公司］。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取本品干燥粉末（過3 號篩）約0.50 g，置于50 mL 錐形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理40 min（250 W、50 kHz），放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 對照品適量，置于25 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，分別制成10.591、18.176、76.167、58.842、99.172、275.825、42.408、51.244、58.678 μg/mL 對照品溶液（甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.020 7）。

2.3 色譜條件 Waters SunfireTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210、230、283、345 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，混勻，得到系列質量濃度溶液B1～B5，在“2.3”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，信噪比（S/N）≥10 為定量限，S/N≥3 為檢測限，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（B3）5.0 μL，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6 次，測得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD 分別為2.04%、1.81%、1.23%、0.91%、0.77%、0.56%、0.97%、1.63%、1.54%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（SSW1），分別于0、2、4、8、12、24 h，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD 分別為1.93%、1.69%、1.03%、0.89%、0.86%、0.41%、0.94%、1.53%、1.37%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批本品（SSW1）粉末6 份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD分別為0.97%、0.88%、0.71%、0.63%、0.66%、0.24%、0.61%、0.68%、0.78%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取含有量已知的本品（SSW1）粉末約0.50 g，精密加入適量對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。測得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d平均加樣回收率分別為100.1%、99.7%、99.3%、99.8%、100.4%、99.5%、95.1%、102.3%、97.7%，RSD 分別為 0.64%、1.89%、1.43%、0.74%、0.85%、1.76%、0.84%、0.48%、3.11%。

2.5 樣品含有量測定 取5 批本品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表3。

3 討論

3.1 指標成分選擇 中成藥組分較多，制備工藝復雜，使其質量難以得到較好的控制［8-9］。十三味和中丸由四逆散、左金丸、金鈴子散、二陳湯四方相合，配伍黃芩、砂仁2 味藥材而成，以四逆散為疏肝理氣之母方，并以大量枳殼替代枳實，全方以枳殼為君藥，柴胡、炒白芍、姜半夏、陳皮、延胡索為臣藥［10］。前期曾考慮選擇母方中3 味藥材（柴胡、炒白芍、甘草）、君藥與臣藥（枳殼、柴胡、炒白芍、姜半夏、陳皮、延胡索）、額外配伍藥（酒黃芩、砂仁）作為研究對象，但砂仁有效成分大多為揮發(fā)性物質，2015 年版《中國藥典》采用GC 法進行定量測定，而半夏含有量在藥典中采用電位滴定法進行測定，故未選擇兩者作為質控指標。結合處方用量（酒黃連用量較大），本實驗最終選擇枳殼、柴胡、炒白芍、陳皮、延胡索、酒黃連、酒黃芩、甘草8 味藥材，并參考藥典方法對其特征性成分（如枳殼中柚皮苷、炒白芍中芍藥苷等）進行分析。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分含有量測定結果（mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.2 提取條件選擇 本實驗以不同體積分數(shù)甲醇、乙醇為溶劑，考察了超聲、回流、索氏提取及不同提取時間。綜合考慮方法穩(wěn)定性、便捷性、提取效率，最終選擇70%甲醇超聲處理40 min 作為供試品溶液提取方法。

3.3 流動相選擇 本實驗考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，最終選擇乙腈-0.2% 磷酸作為流動相，此時色譜峰分離度、峰形良好。同時，將洗脫時間延長到128 min，也為指紋圖譜（或特征圖譜）等后續(xù)研究提供基礎。

3.4 檢測波長選擇 根據(jù)不同成分在紫外光下的吸收情況，本實驗選擇最大吸收波長（或其左右）以避免其他物質干擾，保證測定準確性。結合2015 年版《中國藥典》，最終確定各成分檢測波長分別為210 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）、230 nm（芍藥苷、甘草酸）、283 nm（芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷）、345 nm（鹽酸小檗堿），此時色譜峰分離度、峰形理想，可用于定量分析。

4 結論

本實驗建立了HPLC 法同時測定十三味和中丸中芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含有量，該方法簡便，重復性好，可為該制劑質量控制提供參考，并為今后特征圖譜、中藥標準物質的研究［11-14］奠定了一定的理論基礎。