劉雅琳王文愷李秋芳薛 梅

［1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結合學院，江蘇 南京 210023；3.河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院）， 河南 鄭州 450002］

當歸補血湯源自李東垣《內外傷辨惑論》，由黃芪、當歸2 味藥材按5∶1 比例組成，是補益劑代表方，主治血虛陽浮發(fā)熱證，對勞倦內傷、氣血兩虛、浮陽外越、女人行經(jīng)、產(chǎn)后血虛發(fā)熱、長陽久潰不愈有明顯療效［1］，具有促進骨折愈合［2-3］、治療再生障礙性貧血［4］、調節(jié)免疫［5］、減少2 型糖尿病引起的腎臟損傷、抗炎、抗氧化等作用。

藥代動力學是應用動力學原理與數(shù)學處理方法，定量描述藥物通過各種途徑（如靜脈注射、靜脈滴注、口服給藥等）進入體內后吸收、分布、代謝、排泄過程“量時”或血藥濃度“經(jīng)時”變化動態(tài)規(guī)律的一門學科，在闡明中藥進入體內后的動態(tài)變化規(guī)律、指導臨床合理用藥、對某些藥理現(xiàn)象作出準確解析等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。因此，本實驗在文獻［6］的基礎上通過UPLCMS/MS 法研究當歸補血湯在大鼠血漿中的藥代動力學，為該方臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪為蝶形花科植物內蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.的根，當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的根，均購自北京同仁堂大藥房，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥理教研室卞勇老師鑒定為正品。

阿魏酸（批號MUST-17010908）、毛蕊異黃酮（批號 MUST-14070923）、芒柄花黃素（批號MUST-14091205）、黃芪甲苷（批號 MUST-15072911）、橙皮素（批號MUST-17040814）對照品均由成都曼斯特生物科技有限公司提供（質量分數(shù)＞99%）。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；水為超純水（Milli-Q 純水機生產(chǎn)）。

1.2 儀器 AcquityTMUPLC 色譜儀（配置四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器）、AcquityTMUPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、XevoTMTQ 質譜系統(tǒng)、Mass Lynx4.1 質譜工作站軟件（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司）；渦旋儀（海門市齊林貝爾儀器制造有限公司）；SPD-2010 離心濃縮裝置、SL16R 高性能臺式冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；RC 2 Basic 低溫冷卻循環(huán)泵（德國IKA 公司）；Freezone-12 L 冷凍干燥機（美國Labconco 公司）；旋轉蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；MS7-H550-Pro 加熱型磁力攪拌器（美國賽洛捷克公司）。

1.3 動物 清潔型雄性SD 大鼠，體質量（250±10）g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2017-0001，自由攝食飲水。環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度50%，12 h白天/12 h 黑夜模式，每天7：00 至19：00。大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，開始實驗。

2 方法與結果

2.1 分析條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，95% A，5% B；1～4 min，95%A～0，5%～100% B；4～6 min，100% B）；體積流量0.4 mL/min；樣品盤溫度10 ℃；進樣量2 μL。電噴 霧正離 子源（ESI+）；MRM 采集方式；毛細管電壓3 kV；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度350 ℃。主要MS 參數(shù)見表1。

2.2 溶液制備 精密稱取阿魏酸、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、黃芪甲苷對照品適量，甲醇分別制成1.980、4.540、1.332、1.100 g/L，精密量取適量，甲醇制成每 1 mL 分別含四者 495.00、1 135.00、333.13、275.00 μg 的混合標準品溶液。精密稱取橙皮素（內標）對照品適量，加甲醇制成0.332 mg/mL，再進一步稀釋成3.32 μg/mL 內標溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各成分主要MS 參數(shù)Tab.1 Main MS parameters for various constituents

2.3 樣品準備

2.3.1 當歸補血湯凍干粉制備 黃芪、當歸按5∶1比例稱取300 g，置于燒杯中，8 倍量純水室溫下浸泡60 min，置于加熱型磁力攪拌器上，設定溫度為550 ℃，加熱至沸騰后380 ℃下繼續(xù)煎煮30 min，8 層脫脂紗布過濾，得到湯劑藥液A，殘渣再倒入6 倍量水，重復上述方法煎煮過濾，得到湯劑藥液B，合并2 次藥液，60 ℃下濃縮至300 mL，冷凍干燥24 h，即得。得率（凍干粉量/生藥量）為40.55%（121.6 g/300 g），取出后將其迅速轉移至自封袋中，置于低溫、干燥避光處保存?zhèn)溆?。另外，課題組前期［7］測得當歸補血湯中阿魏酸、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、黃芪甲苷質量分數(shù)分別為0.34、0.64、0.67、0.113 mg/g。

2.3.2 灌胃藥液制備 取適量凍干粉置于燒杯中，加入80 ℃熱水溶解，制成相當于2 g/mL 生藥量的湯劑，灌胃體積為10 mL/kg，相當于生藥量20 g/kg（為臨床用量的5 倍，約含阿魏酸6.8 mg/kg、毛蕊異黃酮12.8 mg/kg、芒柄花黃素13.4 mg/kg、黃芪甲苷2.26 mg/kg）［7］。

2.3.3 血漿樣品采集 取6 只雄性大鼠，給藥前12 h 禁食，自由飲水，在灌胃給予當歸補血湯后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各0.3 mL，肝素鈉抗凝，4 ℃下13 000 r/min 離心5 min，取上層血漿，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，其間每取血4 次，即皮下注射生理鹽水1 mL 以保持循環(huán)血量穩(wěn)定。

2.3.4 血漿樣品處理 上述冷凍血漿室溫下溶解，取100 μL 置于1.5 mL EP 管中，加內標溶液10 μL、甲醇1 mL，渦旋2 min 后4 ℃下15 000 r/min 離心10 min，取全部上清液轉移至另一EP 管中，40 ℃下離心濃縮至完全干燥，加入100 μL 甲醇渦旋5 min復溶干燥沉淀物，4 ℃下15 000 r/min 離心10 min 后取上清2 μL，注入UPLC-MS/MS 系統(tǒng)進樣分析。

2.3.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以（）表示。血藥濃度-時間數(shù)據(jù)通過DAS 3.0 軟件按非房室模型處理，計算藥動學參數(shù)，再通過SPSS 22.0 軟件進行處理。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取大鼠空白血漿、空白血漿+混標溶液+內標溶液、含藥血漿+內標溶液，按“2.3.3”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣測定，結果見圖1，可知大鼠血漿內源性物質不干擾測定，專屬性良好。

圖1 專屬性試驗色譜圖Fig.1 Specific test chromatograms

2.4.2 線性關系考察 取大鼠空白血漿80 μL，加入“2.2”項下不同質量濃度溶液各10 μL，渦旋混勻2 min，配制成含阿魏酸1.93～495.00 ng/mL、毛蕊異黃酮2.22～1 135.00 ng/mL、芒柄花黃素2.60～333.13 ng/mL、黃芪甲苷2.15～275.00 ng/mL 6 個不同質量濃度的血漿樣品，按“2.3.4”項下方法處理后在“2.1”項條件下進樣測定。以待測成分、內標峰面積比值（Y）對溶液質量濃度（X）進行回歸，最低定量限以S/N≥10 計，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 基質效應、提取回收率 在按“2.3.3”項下方法預處理后的空白血漿中加入“2.2”項下不同質量濃度溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，計算基質效應；配制不同質量濃度混合標準品，平行3 份，按“2.3.3”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣測定，計算提取回收率，結果見表3。

2.4.4 精密度、準確度試驗 配制“2.2”項下不同質量濃度混合標準品，平行3 份，按“2.3.3”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣測定，同一天內于不同時間點各進行1 次，計算日內精密度；連續(xù)幾天進行，每天1 次，計算日間精密度，將進樣后所得峰面積與內標峰面積的比值代入回歸方程，所得質量濃度與實際質量濃度的比值即為準確度。結果，不同質量濃度下各成分日內、日間精密度RSD 均小于11.79%，準確度在94.41%～110.46%之間，表明該方法精密度、準確度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 配制“2.2”項下不同質量濃度混合標準品，平行3 份，分別考察室溫下放置6 h、4 ℃下自動進樣器內放置24 h、冷凍-解凍3個循環(huán)時的穩(wěn)定性，結果見表4，可知該方法穩(wěn)定性良好。

表3 各成分基質效應、提取回收率測定結果Tab.3 Results of matrix effect and extraction recovery determination of various constituents

2.5 藥動學研究 圖2 顯示，芒柄花黃素吸收代謝相對較慢，60 min 才達到最大血藥濃度；阿魏酸吸收基本呈單峰，20 min 左右血藥濃度即達到最高；毛蕊異黃酮吸收也呈單峰；黃芪甲苷在體內有2 個吸收高峰，在60 min 時血藥濃度達到最高峰，之后緩慢下降，但在240 min 左右又出現(xiàn)另1 個高峰。具體參數(shù)見表5。

圖2 各成分血藥濃度-時間曲線Fig.2 Blood concentration-time curves for various constituents

表5 各成分主要藥動學參數(shù)（n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（n＝6）

3 討論

中藥方劑體內吸收多種物質的藥動學一直是中藥方劑藥效研究的重點和指導臨床中藥方劑使用的關鍵［8］。王文萍等［6］報道了當歸補血湯不同藥材配伍比例中阿魏酸、黃芪甲苷藥動學差異，但考慮到中藥方劑成分的復雜性，這仍不足以為臨床用藥提供一個較為可靠的用藥模型。

阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗抑郁作用［9-10］，本實驗發(fā)現(xiàn)該成分含有量在大鼠灌胃給藥20 min后即達到最高，同時MRT0～∞也相較于其他成分短，與文獻［11］報道一致，表明其體內吸收代謝過程較快，可能與其較小的分子量、組織內廣泛的分布、首過效應［12-13］有關。黃芪甲苷體內吸收慢，含有量、利用率低，但出現(xiàn)2 個吸收高峰，Yi等［14］發(fā)現(xiàn)肝腸循環(huán)和腸道微生物群是二次吸收高峰出現(xiàn)的主要原因。

黃酮類物質在中藥化學成分中占據(jù)重要位置［15］，本實驗對黃芪中含有量較高的2 種代表性黃酮——毛蕊異黃酮、芒柄花黃素進行準確定量分析，從AUC0～∞來看，前者體內吸收量遠大于后者，這與文獻［14］報道一致。大量研究表明，除了毛蕊異黃酮外，黃芪中還含有大量毛蕊異黃酮葡萄糖苷［16-17］，Ruan 等［18］認為它可在腸道菌群的作用下水解為苷元——毛蕊異黃酮，后者高滲性可促進其吸收，并在體內水解為游離毛蕊異黃酮［19］，增加體內總量，可能是兩者體內含有量差異的主要原因。

綜上所述，本實驗建立了UPLC-MS/MS 法來對大鼠灌胃當歸補血湯后血漿中酚酸類、黃酮類、皂苷類成分進行快速、高效、準確的定量分析，并通過DAS 軟件擬合出藥時曲線，可為該方臨床應用和質量監(jiān)控提供參考。