王慧芳，趙飛燕，劉勇軍，趙潤(rùn)柱，王 曼，姚 英，張恒慧

（1.太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原 030008；2.渾源一中化學(xué)組，山西 大同 037400；3.太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

黃酮又稱(chēng)黃堿素，是一種以2-苯基色原酮為基本結(jié)構(gòu)的化合物，常在植物體內(nèi)與糖結(jié)合成苷［1］，大多數(shù)植物都含有此類(lèi)化合物，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物激素、防治心血管疾病、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)機(jī)體健康等功效［2-3］，關(guān)于其抗氧化、抑菌活性的報(bào)道也很多［4-6］。課題組前期采用HP-20 型大孔樹(shù)脂對(duì)提取得到的陳皮黃酮進(jìn)行分離提純后，測(cè)定它對(duì)3 種革蘭氏菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的效果最佳［7］。

文冠果Xanthoceras sorbifoliaBunge 為無(wú)患子科文冠果屬木本落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)于我國(guó)西北部，是一種食用油料樹(shù)種，壽命可超過(guò)200 年，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［8-10］，其葉中也含有大量黃酮類(lèi)化合物［11］。目前，對(duì)文冠果的研究主要集中在育苗、種植［12-13］、不同部位揮發(fā)油提取、理化性質(zhì)、成分分析等方面［14-18］，而關(guān)于黃酮提取及其生物活性方面的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行微波輔助酶提取文冠果葉總黃酮，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化該成分提取工藝，并對(duì)其抗氧化、抑菌活性進(jìn)行初步探索，旨在為油料作物多重開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

文冠果葉采自山東，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院裴香萍副教授鑒定為正品。蘆丁對(duì)照品（純度＞98%）購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；纖維素酶（活性1.5 萬(wàn)U/g）購(gòu)自上海如吉生物科技有限公司；茶多酚（純度＞98%）購(gòu)自上海今品化學(xué)技術(shù)有限公司。DPPH·、ABTS·購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。VIS-7220型光度計(jì)購(gòu)自上海棱光科技有限公司；XH-10A 型微波儀購(gòu)自北京祥鵠科技有限公司；DHP-9082 型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海雷韻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HB-10 型旋蒸儀購(gòu)自德國(guó)IKA 公司；FA-2104 型數(shù)顯電子分析天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。氫氧化鈉、氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、磷酸、濃鹽酸等均為分析純，購(gòu)自天津化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 總黃酮提取 采用微波輔助酶法。將文冠果葉烘干、粉碎、過(guò)60 目篩后，稱(chēng)取0.5 g 粉末于50 mL 圓底燒瓶中，加入3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH=4.5）和適量纖維素酶，55 ℃下水浴酶解60 min后沸水浴滅酶，冷卻10 min，加入適量乙醇室溫浸泡0.5 h，微波提取，2 000 r/min 離心10 min，取上層清液，洗滌后合并濾液，抽濾，濃縮，即得提取物。

2.2 總黃酮含有量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察［19］以吸光度為縱坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A=8.517 0X+0.006 2（R2=0.999 2），在0～70 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 提取率測(cè)定 公式為提取率=（黃酮含有量/樣品粉末量）×100%。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)［20］配制0.1 mg/mL 蘆丁對(duì)照品溶液，于0、2、4、6、8、10 h 測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為0.198%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取0.1 mg/L 蘆丁對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定吸光度6 次，測(cè)得其RSD 為0.346%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取0.050 6 mg/L 提取液10 mL，共9 份，置于50 mL 量瓶中，加入0.063 2、0.050 6、0.042 2 mg/L 蘆丁對(duì)照品溶液10 mL，共3 份，75%乙醇定容，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，3 份溶液回收率分別為98.7%、99.5%、101.0%，RSD 為1.58%。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 微波功率 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，微波提取時(shí)間3 min，選擇微波功率400、500、600、700、800 W，按“2.1”項(xiàng)下方 法提取。

2.3.2 微波提取時(shí)間 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，微波功率600 W，選擇微波時(shí)間1、3、5、7、9 min，按“2.1”項(xiàng)下方法提取。

2.3.3 料液比 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，微波功率600 W，微波提取時(shí)間5 min，選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按“2.1”項(xiàng)下方法提取。

2.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取時(shí)間5 min，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%，按“2.1”項(xiàng)下方法提取。

2.3.5 纖維素酶用量 固定樣品粉末用量0.5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取時(shí)間5 min，選擇纖維素酶用量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，按“2.1”項(xiàng)下方法提取。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇微波功率（A）、微波提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5 抗氧化活性測(cè)定

2.5.1 藥液配制 將最優(yōu)條件下得到的提取液在50～55 ℃下濃縮至2.01 mg/mL，75%乙醇依次稀釋至5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/mL，并配制相同質(zhì)量濃度維生素C、蘆丁溶液作為對(duì)照，冷藏備用。

2.5.2 對(duì)DPPH·的清除能力［20］公式為清除率=，其中Ai為樣品組（提取液+DPPH 溶液）吸光度，Aj為等體積無(wú)水乙醇代替DPPH 溶液的對(duì)照組吸光度，A0為等體積蒸留水代替提取液的空白組吸光度。

2.5.3 對(duì)ABTS·的清除能力（對(duì)文獻(xiàn)［20］稍作改動(dòng)）精密稱(chēng)取0.040 g ABTS 加入1.0 mg/mL K2S2O8溶液8.0 mL，密封避光反應(yīng)16 h，置于250 mL 量瓶中，加入32 mL 去離子水，95% 乙醇定容，靜置10 h，作為ABTS 工作液。然后，精密吸取不同質(zhì)量濃度提取液（或蘆丁、維生素溶液）各0.50 mL，加入0.80 mL ABTS 工作液，再加入2.70 mL 80%乙醇，反應(yīng)6 min 后在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參比液為75%乙醇與無(wú)水乙醇（1∶1）混合液，按“2.5.2”項(xiàng)下公式計(jì)算。

2.6 抑菌活性測(cè)定

2.6.1 被測(cè)菌種擴(kuò)培 參考文獻(xiàn)［21］方法進(jìn)行操作。

2.6.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 將提取液按“2.5.1”項(xiàng)下方法濃縮后，室溫下晾干冷藏。50%乙醇配制總黃酮粗提物、茶多酚供試液，藥液質(zhì)量濃度分別為8.56、4.28、2.14 mg/mL。濾紙片法［22］測(cè)定粗提物、茶多酚抑菌活性，方法為將培養(yǎng)基在37 ℃恒溫箱中保溫48 h 后，測(cè)定抑菌圈直徑（十字交叉測(cè)2 次，取平均值），公式為抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-濾紙片直徑。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 微波功率［23］圖1 顯示，總黃酮提取率隨著微波功率升高而先增后減，其原因是微波離子傳導(dǎo)作用可隨其功率增大而加強(qiáng)，促使文冠果葉細(xì)胞膜膨化、破裂，總黃酮，于功率為600 W 時(shí)全部溶出；繼續(xù)增大微波功率時(shí)，不但損耗能量，而且過(guò)剩的熱效應(yīng)會(huì)促使總黃酮分解［24］，故確定微波功率為600 W。

圖1 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

3.1.2 微波提取時(shí)間 圖2 顯示，當(dāng)微波提取時(shí)間小于5 min時(shí)，總黃酮提取率隨著時(shí)間延長(zhǎng)熱效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，釋放量隨之增大，在5 min 時(shí)最高，表明該成分已完全釋放；在7 min 時(shí)，提取率略有下降；在9 min 時(shí)，提取率迅速下降，主要是由于過(guò)量熱效應(yīng)可使總黃酮分解，故確定微波時(shí)間為5 min。

圖2 微波提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the extraction rate of total flavonoids

3.1.3 料液比 圖3 顯示，隨著料液比中乙醇用量增加，總黃酮逐漸被溶出，提取率逐漸增加；但其過(guò)量時(shí)，反而會(huì)因雜質(zhì)溶出而導(dǎo)致總黃酮提取率下降，故確定料液比為1∶20。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

3.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù) 圖4 顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，總黃酮提取率隨著其升高而增加，并在70% 時(shí)達(dá)到溶解平衡，提取率最高；大于70%時(shí)，過(guò)量滲透壓會(huì)將文冠果葉中雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取率反而下降，故確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3.1.5 纖維素酶用量［25］圖5 顯示，當(dāng)纖維素酶用量在0.05%～0.20%之間時(shí)，隨著文冠果葉細(xì)胞壁被逐漸破壞，總黃酮被逐漸釋放出，其提取率也隨之增加；在0.20%～0.25%之間時(shí)，提取率卻在下降，這是因?yàn)檫^(guò)度破壞細(xì)胞壁會(huì)增加雜質(zhì)溶出，故確定纖維素酶用量為0.20%。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化 通過(guò)Design-Expert 8.0.5 軟件，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方程為Y=9.86-0.14A+0.46B-0.065C-0.167AB+0.34AC-0.063BC-0.21A2-0.28B2-0.21C2。

圖5 纖維素酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of cellulase consumption on the extraction rate of total flavonoids

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

方差分析見(jiàn)表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬性不顯著；R2為0.999 6，表明模型回歸顯著，準(zhǔn)確度高；為0.999 0，表明總黃酮提取率與各因素之間相關(guān)度較高；CV 僅為0.72%，表明模型可靠性高；模型F值與變量對(duì)響應(yīng)值影響呈正比［26］，故各因素影響程度依次為微波提取時(shí)間（B）＞微波功率（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C），與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致；兩因素相互作用影響程度依次為AC＞BC＞AB。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖6。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 最優(yōu)工藝為纖維素酶用量0.20%，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.10%，料液比1∶20，微波功率597.19 W，提取時(shí)間6.49 min，總黃酮提取率為9.92%，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)操作，將其修正為微波功率600 W，提取時(shí)間6 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，其他條件不變。然后，進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取率為9.90%，接近預(yù)測(cè)值9.92%，表明模型擬合情況良好。

圖6 各因素響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for various factors

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.4 抗氧化活性

3.4.1 對(duì)DPPH·的清除能力 圖7顯示，各樣品對(duì)DPPH·的清除能力依次為維生素C＞總黃酮＞蘆丁，并均在被測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2在0.959 6～0.982 2 之間，IC50分別為3.82、12.23、49.36 μg/mL，其中維生素C、總黃酮清除能力均隨著其質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，而蘆丁受其影響相對(duì)較小。另外，總黃酮質(zhì)量濃度為15.00 μg/mL時(shí)清除能力較小，可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差所致，需作進(jìn)一步研究。

圖7 各樣品對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging abilities of various samples on DPPH·

3.4.2 對(duì)ABTS·的清除能力 圖8顯示，各樣品隨著其質(zhì)量濃度升高對(duì)ABTS·的清除能力也隨之加強(qiáng)，其中總黃酮在低質(zhì)量濃度下與維生素C 差距較大，而與蘆丁接近，但進(jìn)一步升高時(shí)逐漸接近維生素C，同時(shí)三者均在被測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2在0.972 0～0.984 8 之間，IC50分別為1.59、14.59、42.90 μg/mL。與DPPH·比較，總黃酮對(duì)ABTS·的清除能力相對(duì)較弱，質(zhì)量濃度均為25.00 μg/mL 時(shí)低了2.60%。

圖8 各樣品對(duì)ABTS·的清除能力Fig.8 Scavenging abilities of various samples on ABTS·

3.5 抑菌活性 表4 顯示，總黃酮、茶多酚對(duì)3種革蘭氏菌的抑制作用隨著其質(zhì)量濃度升高而加強(qiáng)，程度依次為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌，其中總黃酮質(zhì)量濃度為8.56、4.28、2.14 mg/mL 時(shí)抑菌圈直徑分別比茶多酚大了1.12、0.38、0.06 mm，比95% 乙醇大了0.42、1.04、0.80 mm；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用相對(duì)較弱，僅其質(zhì)量濃度為8.56 mg/mL 時(shí)抑菌圈直徑比茶多酚大0.30 mm，但整體上仍比95% 乙醇強(qiáng)；在質(zhì)量濃度8.56 mg/mL 下對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用比茶多酚強(qiáng)，而在8.56、4.28 mg/mL 下強(qiáng)于95%乙醇。

表4 各樣品抑菌活性測(cè)定結(jié)果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

表4 各樣品抑菌活性測(cè)定結(jié)果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)文冠果葉總黃酮微波輔助酶提取工藝為磷酸緩沖液（pH=4.5）3 mL，纖維素酶用量0.20%，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，微波功率600 W，提取時(shí)間6 min，總黃酮提取率為9.90%，接近于預(yù)測(cè)值，表明工藝準(zhǔn)確可靠，比郝倩［11］等報(bào)道的超聲法提高了2.44 倍?？傸S酮提取液對(duì)DPPH·、ABTS·均有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)前者作用更強(qiáng)，雖然略低于維生素C，但明顯高于蘆??；對(duì)3 種革蘭氏菌均有較強(qiáng)的抑制作用，程度依次為大腸桿菌＞金黃色葡萄球桿菌＞枯草芽孢桿菌，并且對(duì)大腸桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于茶多酚，而對(duì)后兩者則相對(duì)較弱。

綜上所述，文冠果葉總黃酮不但具有較強(qiáng)的抗氧化能力，還有著良好的抑菌活性（尤其是對(duì)大腸桿菌），表明該植物可作為天然抗氧化劑和抑菌劑應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)，開(kāi)發(fā)前景廣闊。