呂佳佳， 姜永紅

作者單位：200032上海，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院兒科

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)已成為引起兒童肺炎的常見病原體，其主要通過呼吸道飛沫傳播。近年來肺炎支原體肺炎病例有逐漸上升的趨勢，國內(nèi)有地區(qū)報(bào)道，MP居各種病原體感染的首位[1]。MP易引起重癥和多系統(tǒng)損傷，肺炎支原體肺炎的肺外表現(xiàn)主要以心血管系統(tǒng)受累最為常見，羅獻(xiàn)民[2]研究顯示感染MP的患兒均有不同程度的心肌酶譜升高。除外，還表現(xiàn)為心率增快、心音低鈍等，心肌炎和心律失常，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心力衰竭，甚至心源性休克。

MP感染并發(fā)心肌損傷國內(nèi)研究較少，年幼時(shí)心肌損傷可能和成年后心肌病有一定的關(guān)聯(lián)，因此早期關(guān)注和發(fā)現(xiàn)患兒的心肌損傷，并積極加以治療干預(yù)，對兒童的健康成長有一定的幫助。本研究旨在應(yīng)用虎杖提取物干預(yù)MP感染后小鼠的心肌損傷，保護(hù)受損的心臟功能，對改善感染MP合并心肌損傷患兒的預(yù)后有積極的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 中藥提取及制備 虎杖購置于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?批號：160721)。取虎杖200 g，置于3 L圓底燒瓶中，加6倍95%乙醇回流提取兩次，第一次4 h，紗布過濾；第二次2 h，紗布過濾，合并兩次的過濾液，將濾液置于圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀調(diào)節(jié)溫度至60 ℃，回收乙醇。將藥液倒入蒸發(fā)皿中于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。小鼠用藥劑量換算采用Bios氏公式，體質(zhì)量按20 kg兒童計(jì)算，虎杖根據(jù)兒童臨床用量為9 g，Da=9 g/20(kg·d)，Db=Da×12.33=110.97 g/20(kg·d)。將虎杖提取物溶于雙蒸水中，小鼠用量為0.25 mL/20 g，虎杖提取物濃度為443.88 g/L。

1.2 支原體菌株及培養(yǎng)基 MP國際標(biāo)準(zhǔn)株MPFH(美國ATCC，貨號：15531)。支原體肉湯基礎(chǔ)CM403、支原體添加劑-G SR0059(BD公司，貨號：255420)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組 BALB/c雄性小鼠30只，體質(zhì)量(18±2)g，3周齡，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016]，檢疫后備用。SPF級動物房，正常組與模型組隔離飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、MP模型組、虎杖提取物組，每組10只。

1.4 主要試劑及儀器 小鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)ELISA試劑盒(XY-Biotechnology，批號：2018060114)；MP核酸檢測試劑盒(達(dá)安基因，貨號：Cat，#DA-D064)；酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)公司，貨號：DNM-9602)；Real-time檢測儀(ABI，貨號：ABI-7300)。

1.5 支原體菌液培養(yǎng) 將MP菌株接種至支原體肉湯培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)菌液顏色由暗紅色變成均勻一致的黃色時(shí)收獲MP菌液，采用顏色變化單位(CCU)方法測定MP濃度，調(diào)整濃度至1×107CCU/mL，作為工作菌液。

1.6 造模及給藥方法 正常組用50 μL生理鹽水滴鼻，MP模型組和虎杖提取物組均用50 μL支原體菌液(菌液濃度為1×107CCU/mL)滴鼻感染BALB/c小鼠，連續(xù)3 d。治療從感染第1天開始。正常組和MP模型組以生理鹽水0.25 mL/20 g灌胃，虎杖提取物組0.25 mL/20 g灌胃，連續(xù)3 d。

1.7 標(biāo)本采集及檢測 第4天處死取材，小鼠摘眼球取血，8 000 r/min離心，取上清液，用MP核酸檢測試劑盒檢測MP感染情況，結(jié)果陽性即MP造模成功。造模成功則檢測小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb和AST的水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清MP-DNA定量比較 見表1。

表1 各組小鼠血清MP-DNA定量比較

注：與MP模型組比較，aP<0.01。

表1結(jié)果表明，正常組MP-DNA基因拷貝數(shù)顯示無MP感染，而模型組有MP感染，表明造模成功；與MP模型組相比，虎杖提取物組的MP-DNA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 各組小鼠血清CK-MB、cTnI、Mb、AST水平的比較 見表2。

表2 各組小鼠血清CK-MB、cTnI、Mb、AST水平的比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與MP模型組比較，bP<0.01。

表2結(jié)果表明，與正常組相比，MP模型組小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與MP模型組相比，虎杖提取物組小鼠血清中CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，支原體肺炎合并心肌損傷與感染、免疫因素有關(guān)，其致病機(jī)制主要有：MP直接侵入，MP進(jìn)入血液粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，使血管通透性增加，炎性細(xì)胞浸潤心肌間質(zhì)，能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，主要有白細(xì)胞介素-1、-6、-2，腫瘤壞死因子α，γ干擾素，導(dǎo)致心肌炎；MP抗原與人體心、肺等組織存在著部分共同抗原，感染后可產(chǎn)生相應(yīng)組織的自身抗體，形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致心肌的免疫損傷[3]；MP感染時(shí)肺部組織損傷，肺泡內(nèi)氣體交換面積減少，導(dǎo)致機(jī)體缺血缺氧，氧自由基增多，超氧化物歧化酶活性減低，清除能力下降；IgE與外周血嗜酸性粒細(xì)胞增高，從而導(dǎo)致細(xì)小支氣管管腔狹窄或閉塞引起心肌缺氧損傷[4]。

兒童支原體肺炎的中醫(yī)病機(jī)主要為肺絡(luò)痹阻，因外感溫?zé)岫拘叭敕谓j(luò)，導(dǎo)致肺氣郁閉，血行遲滯、絡(luò)脈失養(yǎng)，進(jìn)一步加重?zé)岫尽⑻禎?、血瘀，三者互結(jié)阻于絡(luò)中，絡(luò)脈長期滯塞不通易導(dǎo)致絡(luò)脈氣血陰陽的損傷，形成虛實(shí)夾雜之證[5]。若感邪較重或正不勝邪，病情進(jìn)展，則可由肺而累積他臟。若邪熱熾盛，內(nèi)陷厥陰，引動肝風(fēng)，則出現(xiàn)高熱、神昏、抽搐等邪陷厥陰之變證；甚或因心失所養(yǎng)，心氣不足，心陽虛衰，而出現(xiàn)面白肢冷，呼吸急促，煩躁不安，脈微欲絕等危重之象[6]。

目前，關(guān)于支原體肺炎合并心肌損傷的病機(jī)尚未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識，眾多醫(yī)家根據(jù)自身的臨床經(jīng)驗(yàn)，從不同的角度進(jìn)行深入探討，多數(shù)認(rèn)為是熱、痰、瘀互結(jié)所致。我團(tuán)隊(duì)從“肺絡(luò)”理論研究支原體肺炎已近10年，我們認(rèn)為，肺之氣絡(luò)不利則不能推動血行，致肺之血絡(luò)壅滯，必然影響心絡(luò)。心之氣絡(luò)和脈絡(luò)相互協(xié)調(diào)，才能維持心臟正常的搏動頻率和節(jié)律，推動血液循脈管周行全身，同時(shí)向心臟自身供血。心之氣絡(luò)郁滯，則心臟搏動頻率和節(jié)律改變，心臟收縮泵血功能異常，出現(xiàn)早搏，心動過速等；心之脈絡(luò)瘀阻，則心臟自身血液供應(yīng)障礙，失于濡養(yǎng)，出現(xiàn)心肌受損。臨床報(bào)道支原體肺炎患兒出現(xiàn)心肌損害的病例不斷增加，與心之氣絡(luò)脈絡(luò)損傷有關(guān)[5]。

虎杖(Polygonum cuspidatumSieb.Et Zucc)性味苦、酸，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有祛風(fēng)利濕、清熱解毒、散瘀定痛、止咳化痰功效?，F(xiàn)有資料表明其有效成分藥理活性豐富，包括抗炎、抗菌、抗病毒、改變血流變、擴(kuò)張血管、保護(hù)心肌、調(diào)血脂、抗血栓、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)在氧糖剝奪/再復(fù)氧條件下，虎杖苷提高了H9C2細(xì)胞的存活率，同時(shí)其可以激活JAK-STAT3信號通路，從而對心缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[8]?；⒄溶者€能夠下調(diào)急性心肌梗死后大鼠血清中乳酸脫氫酶、CK-MB、肌酸激酶的水平，減少心肌梗死面積，調(diào)節(jié)心臟功能，減輕急性心肌梗死后心肌損害的程度，并推測其機(jī)制可能由Nrf2/HO-1通路的激活介導(dǎo)[9]?；⒄溶湛娠@著抑制心肌細(xì)胞缺血后纖維化和細(xì)胞凋亡的病理進(jìn)程，并且對急性心肌梗死后的心律失常及心臟功能有顯著的改善[10]。針對MP感染后合并心肌損傷，我們認(rèn)為是痰瘀阻絡(luò)，本研究選用的虎杖活血散瘀，祛風(fēng)通絡(luò)，且能止咳化痰，在清肺化痰的同時(shí)，通絡(luò)養(yǎng)心，采用化痰通絡(luò)法治療，以期收到良好的療效。

CK-MB是心肌特異性同工酶，在心肌中含量最高，對判斷心肌損害具有高度特異性。當(dāng)心肌受到損傷時(shí)，CK-MB會釋放到外周血，導(dǎo)致外周血CK-MB水平增高，并且不到24 h即可達(dá)到峰值，恢復(fù)到正常的時(shí)間在3～4 d內(nèi)[11]。有研究報(bào)道，通過CK-MB檢測，可判斷重癥肺炎患兒是否并發(fā)心肌損傷及預(yù)后情況。因此，血清CK-MB可作為肺炎心衰的早期診斷指標(biāo)之一[12]。

肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)心肌與橫紋肌收縮的相關(guān)蛋白，肌鈣蛋白共有T、C、I三個亞基，和原肌球蛋白一起調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。cTnI對心肌具有高度的特異性和靈敏度，目前已成為醫(yī)學(xué)研究中最理想的心肌梗死標(biāo)志物。但對于這一指標(biāo)，國內(nèi)外成年人研究較多，但兒童研究較少。cTnI僅存在心肌中，當(dāng)心肌細(xì)胞膜完整時(shí)，cTnI不能進(jìn)入血循環(huán)，故健康人外周血檢測不到cTnI；只有心肌細(xì)胞缺血缺氧發(fā)生變性壞死時(shí)，細(xì)胞膜不完整，cTnI進(jìn)入血循環(huán)，才能檢測到。有研究表明，cTnI水平與心力衰竭嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為心力衰竭的病情監(jiān)測指標(biāo)，評估小兒急性心力衰竭時(shí)心肌損傷的程度[13]。

Mb是心肌和骨骼肌中合成的一種含有亞鐵血紅素的低分子蛋白。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)可較早地影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能缺陷，導(dǎo)致心肌Mb漏出而釋放至血液中。由于其能夠較早的釋放于血液中，因此Mb的靈敏度高，在評價(jià)心肌損傷及診斷、鑒別診斷中具有一定價(jià)值[14-15]。

心肌酶在反應(yīng)心肌細(xì)胞完整性上具有極高靈敏性，AST是心肌內(nèi)眾多的酶類之一。研究發(fā)現(xiàn)AST與肺炎嚴(yán)重程度存在顯著的正向直線相關(guān)關(guān)系，其升高的程度與心肌的損傷程度成正比，檢測AST可及早發(fā)現(xiàn)心肌損傷的程度，表明血清心肌酶在小兒肺炎診斷工作中具有較高價(jià)值[16]。并且，新生兒肺炎無論是輕癥、重癥，還是急性期、恢復(fù)期的心肌酶指標(biāo)相比健康新生兒均有明顯的升高，提示新生兒在肺部感染發(fā)生后常會造成其心肌細(xì)胞炎癥浸潤及受損，臨床醫(yī)生可依據(jù)心肌酶的變化及時(shí)調(diào)整治療方案[17]。

本研究表明，虎杖提取物有抗MP的作用，且MP感染后小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物包括CK-MB、cTnI、Mb、AST的水平均明顯升高，而虎杖提取物組各指標(biāo)表達(dá)均下降顯著，提示虎杖能夠改善MP感染引起的心肌酶譜異常。

綜上所述，虎杖提取物對防治支原體感染合并心肌損傷，保護(hù)患兒心臟功能，改善預(yù)后有積極的臨床意義。