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數(shù)字PCR 應(yīng)用研究進(jìn)展

2020-04-27 06:25:16雷舒文段林潔呂新瑞古曉奎
關(guān)鍵詞:微滴食源性轉(zhuǎn)基因

王 哲,雷舒文,段林潔,呂新瑞,古曉奎

(廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院/廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院,廣東 佛山 528311)

1983 年Kary Mullis 等發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù),開啟了PCR 時(shí)代,促進(jìn)分子生物學(xué)的飛速發(fā)展。第一代普通PCR 技術(shù)的結(jié)果呈現(xiàn)基于凝膠電泳和核酸染料顯色。90 年代美國ABI 公司推出第二代PCR 技術(shù):實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR),以其快速、可視化、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn),迅速而廣泛地占領(lǐng)市場,并在食源病原微生物檢測、臨床病原微生物檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1-3]。但是熒光定量PCR 定量需要標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)際操作中標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)驗(yàn)樣品的擴(kuò)增效率一致性不佳,分析結(jié)果嚴(yán)重依賴循環(huán)閾值(Ct)等,結(jié)果只是相對(duì)定量。Vogelstein 和Kinzler 提出“分而治之(divide and conquer)”的理念,即將一個(gè)PCR 體系利用有限稀釋的方法分割成多個(gè)更小的單元,使每個(gè)單元最多含有一個(gè)目標(biāo)模板,并對(duì)PCR 后的各分區(qū)以終點(diǎn)熒光的“有”或“無”作為判斷標(biāo)準(zhǔn),再利用泊松分布進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,由此發(fā)明了第三代能夠絕對(duì)定量的PCR 技術(shù):數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)。最早的數(shù)字PCR 技術(shù)是在96 或384 孔PCR板上進(jìn)行的[4],反應(yīng)單元少、實(shí)驗(yàn)操作比較繁瑣,精度也比較低。有賴于微機(jī)電制造技術(shù)(MEMS)和微全分析系統(tǒng)技術(shù)(μTAS)的長足發(fā)展,數(shù)字PCR技術(shù)在21 世紀(jì)初獲得了極大發(fā)展。2006 年,Ottesen等[5]利用多層軟刻蝕技術(shù)做出微腔式PCR 芯片,反應(yīng)單元數(shù)增加(最多可實(shí)現(xiàn)20 000 總分區(qū)數(shù)),形成目前所見的由life 公司于2011 年推出的Quant Studio 3D 芯片式數(shù)字PCR 的技術(shù)雛形。多孔蝕刻芯片式數(shù)字PCR 有其結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢,但其存在操作繁瑣,手動(dòng)操作工作量大,實(shí)驗(yàn)成本高等缺點(diǎn),限制了其商業(yè)化進(jìn)程。同時(shí),基于微流控技術(shù)的微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)得到了快速的演進(jìn),相比于多孔芯片式數(shù)字PCR,微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)具有靈活性強(qiáng)(可生成更多數(shù)量的液滴),操作簡單,檢測靈敏度和精度更高等特點(diǎn),因此應(yīng)用范圍比較廣。目前市場占有率較高的產(chǎn)品是2013 年伯樂推出的QX200微滴式數(shù)字PCR 儀,液滴數(shù)量為20 000 每樣本。2012 年Raindance 公司推出Raindrop 數(shù)字PCR 儀,分區(qū)數(shù)達(dá)到驚人的10 000 000 液滴,成為行業(yè)標(biāo)桿,后于2017 年被伯樂收購。國內(nèi)也有多家公司參與數(shù)字PCR 設(shè)備研發(fā),目前已有數(shù)款產(chǎn)品發(fā)布。

1 微滴式數(shù)字PCR 原理

微滴式數(shù)字PCR 實(shí)驗(yàn)過程分為3 部分,分別是樣本微滴制備、微滴PCR 擴(kuò)增和微滴熒光信號(hào)檢測與分析,見圖1。在微流控芯片中,以含有目的樣本的PCR 反應(yīng)試劑為分散相,以與水不混溶的油為連續(xù)相,將PCR 反應(yīng)體系分散至上萬或數(shù)十萬甚至上千萬個(gè)微滴中;然后采用普通PCR 程序進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后,含有目標(biāo)片段的微滴熒光強(qiáng)度增強(qiáng),檢測為陽性微滴(計(jì)為“1”),不含目的片段的微滴熒光值較低,檢測為陰性微滴(計(jì)為“0”),然后將獲得數(shù)據(jù)通過泊松分布模型進(jìn)行分析,計(jì)算出原始樣本中目標(biāo)基因含量。數(shù)字PCR 的定量原理相對(duì)簡單,不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,即能夠?qū)颖局泻怂徇M(jìn)行絕對(duì)的定量。

圖1 數(shù)字PCR 原理圖

2 數(shù)字PCR 的應(yīng)用

微滴式數(shù)字PCR 由于其操作簡單、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),一經(jīng)商業(yè)化就得到廣泛的使用,尤其是在食品安全中的食源性病原微生物和臨床分子診斷中的病毒和腫瘤突變基因等的檢測中。

2.1 dPCR 在食品安全方面的檢測應(yīng)用

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的日益提升,人們對(duì)食品安全問題越來越重視,尤其是對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的關(guān)注,食源致病微生物等問題。相比于傳統(tǒng)檢測方法,數(shù)字PCR 可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品中目標(biāo)核酸拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量,具有絕對(duì)優(yōu)勢,因此被廣泛用于食品安全方面的檢測。

轉(zhuǎn)基因食品被批準(zhǔn)轉(zhuǎn)商業(yè)化應(yīng)用以來,產(chǎn)品和數(shù)量逐年增加,在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)過程中,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因拷貝數(shù)是分析食品安全檢測的重要步驟,目前主要是使用熒光定量PCR 法,需要依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量,無法絕對(duì)定量。大豆是重要的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,轉(zhuǎn)基因方面研究的也比較多,對(duì)比熒光定量PCR 和數(shù)字PCR 的多重PCR 體系在4個(gè)大豆性狀位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因系的檢測效果,熒光定量的費(fèi)用會(huì)低一點(diǎn),但是數(shù)字PCR 能夠更加準(zhǔn)確定量,特異性也更好[6];在加工過的大豆毛油中,利用微滴數(shù)字PCR 技術(shù)測試三組樣品,其中一份含有微量的外源基因,而使用普通PCR 和熒光定量PCR 技術(shù)均未檢測到外源基因,說明數(shù)字PCR 技術(shù)更加靈敏,抗干擾能力也更強(qiáng)[7]。另外在研究轉(zhuǎn)基因玉米時(shí),對(duì)比熒光定量PCR 和數(shù)字PCR 的檢測效果,發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR 更適合檢測玉米外源基因與內(nèi)源基因拷貝數(shù)的比率[8];對(duì)比微滴式數(shù)字PCR 和芯片式數(shù)字PCR 在轉(zhuǎn)基因玉米的雙重檢測效果,兩種方法的定量結(jié)果一致,定量限為0.1%,轉(zhuǎn)基因定量檢測范圍為0.1%~100%,線性度為0.999,精密度優(yōu)于10%[9];Dobnik 等[10]建立針對(duì)歐盟授權(quán)轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測的多重?cái)?shù)字PCR 體系,能夠?qū)崿F(xiàn)大通量檢測,節(jié)約成本。在轉(zhuǎn)基因水稻G6H1 內(nèi)源基因的數(shù)字PCR 檢測中,雙重?cái)?shù)字PCR 的檢測限和定量限分別是3 和25 拷貝,且數(shù)字PCR 雙重的檢測結(jié)果優(yōu)于單重?cái)?shù)字PCR 和熒光定量PCR[11]。數(shù)字PCR 有更高的靈敏性,對(duì)于低豐度樣本檢測結(jié)果好,且對(duì)PCR 抑制劑不敏感,所以數(shù)字PCR 能更加靈敏檢測到微量的外源基因,對(duì)半成品樣本中的微量外源基因也能準(zhǔn)確定量,尤其在測試外源基因含量比率上有獨(dú)特的優(yōu)勢。

食源性病原菌對(duì)人的健康有重要的威脅,常規(guī)的檢測方法和免疫學(xué)方法比較繁瑣,耗時(shí)耗力,檢測靈敏度低,數(shù)字PCR 技術(shù)的快速靈敏準(zhǔn)確特點(diǎn),能夠滿足食品病原菌檢測的需求。常見的食源性致病菌微生物主要分為細(xì)菌性腸道致病菌和食源性病毒。目前已經(jīng)有多種食源性病原體,如大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、諾如病毒等均建立有數(shù)字PCR 檢測方法[12-14]。水是生活必不可少的資源,其干凈與否直接關(guān)系著人類健康,馬薇等[15]利用數(shù)字PCR 通過優(yōu)化試劑、退火溫度等條件,建立起一套檢測水中大腸桿菌數(shù)量的方法,其檢測精度可達(dá)每微升單個(gè)拷貝數(shù)大腸桿菌基因組DNA。董蓮華等[14]以大腸桿菌rfbE 基因?yàn)榘袠?biāo),通過優(yōu)化試劑濃度建立起定量大腸菌O157∶H7 致病菌的數(shù)字PCR 方法,其靈敏度比較高,檢出限為3 拷貝/20 μL。把數(shù)字PCR 技術(shù)與抑制死菌DNA 的疊氮溴化丙錠結(jié)合,能夠快速檢測到食品中活的沙門氏菌,相似的方法可以檢測食品中活的單核細(xì)胞增生李斯特菌[16]。數(shù)字PCR 的高靈敏度特征,對(duì)環(huán)境中低豐度的病原微生物如腸桿菌、沙門氏菌等檢測有明顯的優(yōu)勢,可推廣到其他食源性病原性微生物檢測。

2.2 dPCR 在臨床上的應(yīng)用

1)dPCR 在病毒檢測應(yīng)的用。

由于dPCR 在絕對(duì)定量上有著非常大的優(yōu)勢,自商業(yè)化后,就快速應(yīng)用在病原微生物的檢測上,尤其在病毒定量上應(yīng)用非常廣。臨床上病毒載量的精確化是非常重要的,靈敏的檢測技術(shù)可以指導(dǎo)臨床治療。現(xiàn)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道使用數(shù)字PCR 對(duì)病毒載量的檢測,包括HIV 病毒、HBV 病毒、人博卡病毒、人乳頭病毒等。目前AIDS 尚不能治愈,只能通過治療延長生命,降低傳播風(fēng)險(xiǎn),臨床上HIV 檢測是測定血漿中其RNA 含量,檢測方法還主要是qPCR 技術(shù)[17],dPCR 技術(shù)建立的檢測方法成倍提高了檢出精度,能更早發(fā)現(xiàn)是否感染HIV,及早治療,降低病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)[18]。而HBV 病毒的感染是全球性的,全球有2.4 億感染者,是引起肝癌的主要原因之一,HBV 含量對(duì)腫瘤的發(fā)展有重要的影響,有研究使用dPCR 對(duì)臨床上131 份石蠟切片樣品中HBV含量測定,結(jié)果顯示拷貝數(shù)從1.1~175.5 拷貝/μL 不等,論證分析了HBV 病毒載量、cccDNA 和腫瘤發(fā)展之間關(guān)系[19]。對(duì)于易感嬰幼兒的博卡病毒,以其HBo-sh9 基因的保守序列為檢測靶標(biāo),建立起數(shù)字PCR 檢測方法,不受樣品品質(zhì)和擴(kuò)增效率影響,其定量限低至0.5 拷貝/μL,較常規(guī)PCR 技術(shù)有明顯的優(yōu)勢[20]。病毒載量確定影響臨床用藥治療,數(shù)字PCR 能夠準(zhǔn)確絕對(duì)定量病毒載量,對(duì)臨床治療的指導(dǎo)更有意義,所以數(shù)字PCR 在病毒方向上的研究會(huì)越來越多,應(yīng)用也會(huì)越來越廣泛。

數(shù)字PCR 技術(shù)在動(dòng)物防疫應(yīng)用上也得到了及時(shí)發(fā)展。2018 年在沈陽發(fā)現(xiàn)生豬感染非洲豬瘟后,隨后在全國快速傳播,造成市場豬肉價(jià)格高漲。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的急性傳染病,目前的檢測方法眾多,主要以PCR 和熒光定量PCR 為主,但也存在較多的問題,因此建立數(shù)字PCR 檢測方法是改善檢測技術(shù)的有效手段。原霖等[21]借用數(shù)字PCR 系統(tǒng),建立起一套敏感性高于熒光定量PCR,最低限為0.8 拷貝/μL,重復(fù)性好的方法,適用于非洲豬瘟的早期篩查。

2)dPCR 在腫瘤個(gè)性化檢測診斷中應(yīng)用。

隨著科技的發(fā)展,人們對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)也越來深入,不同階段的標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn),對(duì)儀器設(shè)備檢測的精度要求也越來越高。數(shù)字PCR 能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量、稀有突變的檢測,在對(duì)腫瘤的治療研究中使用越來越多。數(shù)字PCR 具有高靈敏性,可以應(yīng)用在腫瘤早期診斷。骨髓增殖性腫瘤患者中JAK2 V617F 突變是重要指標(biāo),借助數(shù)字PCR 技術(shù)最低檢出率可達(dá)萬分之一,對(duì)于熒光定量技術(shù)無法判定的樣本,數(shù)字PCR 測試結(jié)果能夠準(zhǔn)確做出判定[22],對(duì)比數(shù)字PCR 方法和熒光定量PCR 方法在BCR-ABL1的檢測精度,數(shù)字PCR 的精度比較高,對(duì)治療后期低豐度基因的檢測更加靈敏[23]。毛旭華等[24]對(duì)比微滴式數(shù)字PCR 和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)對(duì)外周血中EGFR 基因突變的檢測效果,58 例樣本結(jié)果顯示數(shù)字PCR 的檢出率高,具有更高的敏感性。腫瘤是一種基因病,如非小細(xì)胞肺癌患者EGFR 存在多種基因突變情況,只有在19 號(hào)外顯子缺失或者21 號(hào)外顯子突變時(shí),采用EGFR 酪氨酸及酶抑制劑才有效果,數(shù)字PCR 能夠檢測低突變率,可提前確定突變類型制定個(gè)性化的治療方案,KRAS 基因的突變與多種癌癥的發(fā)生有關(guān),KRAS 的突變也是有多個(gè)位點(diǎn),鄔升超等[25]人建立多重?cái)?shù)字PCR 檢測方法,能夠準(zhǔn)確檢測患者血漿中游離DNA 中KRAS 的7 中突變,及早制定治療方案。數(shù)字PCR 不僅可以用于早期癌癥突變的篩查,還可以用于治療過程中監(jiān)測及愈后監(jiān)測。隨著患者用藥治療,病灶逐漸減小,突變基因的豐度會(huì)快速降低,數(shù)字PCR 能夠高靈敏監(jiān)測低豐度拷貝數(shù),指導(dǎo)制定合理的停藥時(shí)間,避免治療不足或過度治療。

3 展望

數(shù)字PCR 做為核酸分子的絕對(duì)定量技術(shù),經(jīng)過多年的發(fā)展,在食品安全中的轉(zhuǎn)基因作物檢測、食源性病原微生物的檢測有明顯的優(yōu)勢,在快速準(zhǔn)確檢測微量微生物含量的領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,在臨床應(yīng)用上,由于其高精度、高靈敏性,對(duì)爆發(fā)性流行病、基因病的診斷治療等提供可靠的檢測數(shù)據(jù),指導(dǎo)臨床治療用藥,還可以應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、測序文庫質(zhì)控和基因編輯等領(lǐng)域。隨科技的發(fā)展,數(shù)字PCR 技術(shù)更加成熟,實(shí)驗(yàn)成本會(huì)降低,實(shí)驗(yàn)操作更加簡單自動(dòng)化,應(yīng)用的思路也會(huì)更廣,在微生物定量、基因定量上發(fā)揮更大的作用。

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