梁 英， 胡乃霞， 黃徐林,2， 田傳遠(yuǎn)， 閆譯允， 王 帥

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003； 2. 廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 511400； 3. 海洋活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(自然資源部第一海洋研究所,山東 青島 266061)

微藻種類繁多，數(shù)量龐大，在水域生態(tài)系統(tǒng)中扮演主要初級(jí)生產(chǎn)者的角色[1]。由于微藻具有進(jìn)化多源性和遺傳多樣性，可以產(chǎn)生眾多獨(dú)具特色、結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2-4]。其中，胞外多糖是微藻在生長(zhǎng)過(guò)程中向外分泌的胞外產(chǎn)物的主要組成成分[5]，具有許多特殊的理化性質(zhì)和生物活性[6]。藻膽蛋白屬于捕光色素蛋白，不僅在光合作用中起到吸收和傳遞能量的作用，而且還能在氮源缺乏的情況下作為儲(chǔ)存蛋白供微藻繼續(xù)生存[7]。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)微藻胞外多糖和藻膽蛋白具有許多重要的藥用價(jià)值[8-12]，其含量變化很大程度上與微藻種類及培養(yǎng)條件有關(guān)[13-18]。

氮是四大基本元素之一，為細(xì)胞進(jìn)行能量代謝和物質(zhì)代謝等重要生命活動(dòng)所必需[19]，大多數(shù)微藻主要利用硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)氮等形式[20]。近年來(lái)，已有學(xué)者進(jìn)行了氮源對(duì)微藻生長(zhǎng)、胞外多糖及藻膽蛋白含量影響方面的研究[14-17]。尤珊等[14]研究發(fā)現(xiàn)以尿素和硝酸鈉為氮源時(shí)均有利于鈍頂螺旋藻(Spirulinapla-tensis)的生長(zhǎng)，但藻細(xì)胞對(duì)硝酸鈉的利用率更高，陳新美等[15]則發(fā)現(xiàn)用適宜質(zhì)量濃度的尿素代替硝酸鈉為氮源培養(yǎng)鈍頂螺旋藻時(shí)，既可以加快細(xì)胞生長(zhǎng)又利于增加其藻膽蛋白含量。李戰(zhàn)[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銨鹽對(duì)淡色紫球藻(Porphyridiumpurpureum806)和血色紫球藻(Porphyridiumcruentum)分泌胞外多糖有促進(jìn)作用，史磊[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明，銨鹽對(duì)紫球藻分泌胞外多糖無(wú)促進(jìn)作用。上述研究結(jié)果表明，氮源對(duì)微藻生長(zhǎng)、胞外多糖及藻膽蛋白含量的影響與微藻種類及培養(yǎng)條件有關(guān)，即使對(duì)同一種微藻的研究，不同學(xué)者也得出了不同的結(jié)論，因此需要進(jìn)一步研究。

紫球藻(Porphyridiumsp.)是一種單細(xì)胞紅藻[21]，內(nèi)有一大而呈星形的色素體，貯存著大量藻膽蛋白[22]，一般進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，紫球藻會(huì)在細(xì)胞膜外層分泌胞外多糖形成粘質(zhì)鞘[23]。藍(lán)隱藻(Chroomonasplacoidea)是隱藻門(Cryptophyta)中的一種運(yùn)動(dòng)微藻[24]，藻細(xì)胞內(nèi)只含有一種藻膽蛋白[25]。目前，僅見(jiàn)李戰(zhàn)[16]和史磊[17]有關(guān)氮源對(duì)紫球藻胞外多糖含量影響的報(bào)道以及肖華山等[18]有關(guān)氮源對(duì)紫球藻藻膽蛋白含量影響的報(bào)道，還未見(jiàn)氮源對(duì)藍(lán)隱藻生長(zhǎng)、胞外多糖及藻膽蛋白含量影響的報(bào)道。本文以紫球藻和藍(lán)隱藻為研究對(duì)象，比較分析了不同氮源對(duì)2種微藻的生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響，以期為2種微藻的培養(yǎng)及開(kāi)發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用藻種均取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)，分別為紫球藻(Porphyridiumsp.，MACC/A165)和藍(lán)隱藻(Chroomonasplacoidea，MACC/T11)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以f/2培養(yǎng)基[26]為基礎(chǔ)，選取硝酸鈉、氯化銨、脲和硝酸銨4種氮源，實(shí)驗(yàn)濃度分別為74.8，47.0，26.4和35.2 mg/L，每種氮源的氮濃度均與f/2培養(yǎng)基的氮濃度(12.3 mg/L)相同，每種氮源設(shè)置3個(gè)平行。定時(shí)(次/2 d)定量(5 mL/次)取樣測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)和細(xì)胞密度，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定微藻干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量。

1.3 培養(yǎng)條件

2種微藻均在500 mL三角燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，紫球藻初始接種密度為1.86×105個(gè)/mL，藍(lán)隱藻初始接種密度為1.29×105個(gè)/mL。溫度(23±1) ℃，鹽度32，光照周期18L∶6D，光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1，連續(xù)充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)周期10 d。

1.4 測(cè)定方法

按Liang等[27]方法測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm(光系統(tǒng)II最大光能轉(zhuǎn)化效率)、rETR(相對(duì)電子傳遞效率)、qP(光化學(xué)淬滅系數(shù))和NPQ(非光化學(xué)淬滅系數(shù))，紫球藻和藍(lán)隱藻的細(xì)胞密度分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法和血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定，干重分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法和冷凍干燥法進(jìn)行測(cè)定，胞外多糖和藻膽蛋白含量分別用苯酚硫酸法[28]和蛋白試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Origin8.5軟件繪制圖形，用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析和多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1不同氮源對(duì)紫球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖1A～D反映了不同氮源對(duì)紫球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。由圖1可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)， 不同氮源處理組的Fv/Fm、rETR和qP值總體呈下降趨勢(shì)。第2～4天，氯化銨處理組的Fv/Fm值最大，但第6～10天該值迅速下降，第8～10天硝酸鈉處理組的Fv/Fm值顯著高于其他處理組。第8～10天，硝酸鈉處理組的rETR值最大，氯化銨處理組的rETR值最小。從第2天開(kāi)始，4種氮源對(duì)紫球藻的qP值均有顯著影響(P<0.05)，第8～10天，硝酸鈉處理組的qP值顯著高于其他各組，氯化銨處理組的qP值顯著低于其他各組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，氯化銨處理組的上述3個(gè)熒光參數(shù)均顯著低于其他3組。氮源對(duì)紫球藻NPQ值的影響隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同而變化，第0～4天，各氮源處理組的NPQ值無(wú)顯著差異(P>0.05)，第4～10天，氯化銨和脲處理組的NPQ值整體處于上升趨勢(shì)，2個(gè)硝酸鹽處理組的NPQ值在第6天達(dá)到最大值后持續(xù)下降，第8～10天，氯化銨和脲處理組的NPQ值顯著高于2個(gè)硝酸鹽處理組。

2.2不同氮源對(duì)紫球藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

不同氮源對(duì)紫球藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響見(jiàn)圖2A～D。從圖2中可以得出，4個(gè)氮源處理組紫球藻的細(xì)胞密度在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)一直呈上升趨勢(shì)。多重比較結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)硝酸鈉處理組的細(xì)胞密度最高(6.13×106個(gè)/mL)，氯化銨處理組的最終細(xì)胞密度最低(4.95×106個(gè)/mL)，且2個(gè)處理組均與硝酸銨和脲處理組差異顯著(P<0.05)。不同氮源對(duì)細(xì)胞干重和藻膽蛋白含量的影響規(guī)律相似：硝酸鈉處理組的干重最高(1.4 g/L)，氯化銨處理組的干重最低(0.8 g/L)；2個(gè)硝酸鹽處理組的藻膽蛋白含量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于氯化銨處理組，其中，硝酸銨處理組的藻膽蛋白含量最大，占干重的17.5%。該藻胞外多糖含量隨不同氮源的變化趨勢(shì)與藻膽蛋白相反，以氯化銨為氮源時(shí)，紫球藻胞外多糖含量最高(占干重的29.0%)，顯著高于2個(gè)硝酸鹽處理組，但與脲處理組差異不顯著(P>0.05)。

(abc表示方差分析差異程度，相同字母表明處理組間差異不顯著(P>0.05)；不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)。 abc indicates variance analysis in the difference degree, the same letters indicates no significant difference from each other (P>0.05); The different letters indicates a significant difference from each other (P<0.05).)

2.3不同氮源對(duì)藍(lán)隱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

藍(lán)隱藻在不同氮源培養(yǎng)條件下葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3A～D。如圖3所示，在整個(gè)培養(yǎng)周期中，各個(gè)氮源處理組的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、rETR和qP值變化規(guī)律相似，除氯化銨處理組的rETR值以外，其他處理組的上述參數(shù)均在第2天達(dá)到最大值后持續(xù)下降。多重比較結(jié)果顯示，第6～10天，硝酸鈉處理組的Fv/Fm值顯著高于其他處理組，氯化銨處理組的Fv/Fm值則顯著低于其他處理組。第4～10天，硝酸鈉處理組的rETR值最大，氯化銨處理組的rETR值最小。從第4天開(kāi)始，不同氮源對(duì)藍(lán)隱藻的qP值均有顯著影響(P<0.05)，并且氯化銨處理組的qP值均顯著低于其他處理組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)硝酸鈉處理組的qP值顯著高于其他處理組。不同氮源對(duì)藍(lán)隱藻NPQ值的影響與其他參數(shù)不同，第2～10天，氯化銨處理組的NPQ值最大，且第8～10天，氯化銨處理組的NPQ值顯著大于其他3個(gè)處理組。

2.4不同氮源對(duì)藍(lán)隱藻細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響

圖4A～D表示藍(lán)隱藻在不同氮源培養(yǎng)條件下其細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的變化趨勢(shì)。由圖4可知，4個(gè)處理組的細(xì)胞密度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均呈上升趨勢(shì)，多重比較結(jié)果顯示，第6～10天氯化銨處理組的細(xì)胞密度顯著低于其他處理組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，硝酸鈉處理組的細(xì)胞密度最高(9.2×105個(gè)/mL)，與硝酸銨處理組無(wú)顯著差異(P>0.05)，氯化銨處理組的細(xì)胞密度最低(5.2×105個(gè)/mL)。單因子方差分析結(jié)果表明，不同氮源對(duì)藍(lán)隱藻的干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量的影響差異顯著(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示，硝酸鈉處理組的干重最高(0.72 g/L)，顯著高于其他3個(gè)處理組，氯化銨處理組的干重最低(0.52 g/L)，顯著低于其他3個(gè)處理組。脲和氯化銨處理組的胞外多糖含量顯著高于硝酸銨和硝酸鈉處理組，其中脲處理組的胞外多糖含量最高，占干重的17.5%，但與氯化銨處理組差異不顯著(P>0.05)。該藻藻膽蛋白含量隨不同氮源的變化趨勢(shì)與胞外多糖相反，硝酸銨和硝酸鈉處理組的藻膽蛋白含量顯著高于脲和氯化銨處理組，其中硝酸銨處理組的藻膽蛋白含量最高，占干重的18.8%，但與硝酸鈉處理組差異不顯著(P>0.05)，氯化銨處理組的藻膽蛋白含量最低，僅占干重的6.7%。

(abc表示方差分析差異程度，相同字母表明處理組間差異不顯著(P>0.05)；不同字母表明處理組間差異顯著(P<0.05)。abc indicates variance analysis in the difference degree, the same letters indicates no significant difference from each other (P>0.05); The different letters indicates a significant difference from each other (P<0.05).)

3 討論

植物葉綠素?zé)晒獾膹?qiáng)弱變化可以有效地反映光合作用信息[29-30]，基于此特點(diǎn)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已經(jīng)獲得快速發(fā)展。Fv/Fm表示光系統(tǒng)II最大光能轉(zhuǎn)化效率，反映了環(huán)境變化對(duì)微藻光合作用的影響，該值在環(huán)境脅迫條件下會(huì)明顯下降[31-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫球藻和藍(lán)隱藻硝酸鈉處理組的Fv/Fm值分別在第8～10天和第6～10天顯著大于其他處理組，說(shuō)明以硝酸鈉為氮源時(shí)，藻細(xì)胞可以獲得有效氮素，并且促使光系統(tǒng)II反應(yīng)中心增大開(kāi)放比例，進(jìn)而提高了光能轉(zhuǎn)換效率[33]。這與范麗敏[34]以硝酸鈉為氮源培養(yǎng)棕鞭藻(Ochrosphaeroneopolitana)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)時(shí)，得出其Fv/Fm值均高于氯化銨和尿素處理組的結(jié)果一致。rETR表示相對(duì)電子傳遞效率[35]，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2種微藻硝酸鈉處理組的rETR值最大，而氯化銨處理組的rETR值最小，表明氯化銨作為氮源阻礙了藻細(xì)胞同化力形成，不利于光合電子傳遞，導(dǎo)致電子傳遞速率下降[35]。qP表示光化學(xué)淬滅，反映了光系統(tǒng)II中原初電子受體QA的還原狀態(tài)[36]，該值下降意味著參與光合作用的電子數(shù)目減少，而以熱的形式耗散的光能逐漸增加[37]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2種微藻硝酸鈉處理組的qP值均顯著高于其他處理組，這說(shuō)明以硝酸鈉為氮源時(shí)，紫球藻和藍(lán)隱藻的QA數(shù)量最多，即電子傳遞速率最大，保證光合作用可以正常進(jìn)行。而以氯化銨為氮源時(shí)，2種微藻的上述3個(gè)熒光參數(shù)最小，且顯著低于硝酸鈉處理組，可能是在該氮濃度下，銨態(tài)氮對(duì)藻細(xì)胞有一定的毒害作用[38]，使得PSII反應(yīng)中心受損，抑制了電子傳遞過(guò)程。NPQ表示非光化學(xué)淬滅，將不能及時(shí)耗散的光能傳遞至周圍環(huán)境中以避免對(duì)光合機(jī)構(gòu)的破壞是微藻進(jìn)化過(guò)程中自我保護(hù)的一種體現(xiàn)[36]。第2～10天，紫球藻和藍(lán)隱藻氯化銨處理組的NPQ值均最大，可能以氯化銨為氮源時(shí)，銨態(tài)氮的毒害作用使藻細(xì)胞的光合結(jié)構(gòu)受到破壞，不能充分利用光能，光能大量散失使得NPQ值升高，這一結(jié)果正與前者相吻合。

研究發(fā)現(xiàn)，氮源對(duì)微藻的胞外多糖和藻膽蛋白含量也有顯著影響[16-18]，李戰(zhàn)[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銨鹽對(duì)紫球藻分泌胞外多糖有促進(jìn)作用，而史磊[17]的研究結(jié)果表明，硝酸鈉對(duì)紫球藻分泌胞外多糖有促進(jìn)作用，尿素和氯化銨則不起促進(jìn)作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫球藻氯化銨處理組的胞外多糖含量顯著高于2個(gè)硝酸鹽處理組，藍(lán)隱藻脲和氯化銨處理組的胞外多糖含量顯著高于2個(gè)硝酸鹽處理組，說(shuō)明氯化銨促進(jìn)紫球藻和藍(lán)隱藻分泌胞外多糖，與李戰(zhàn)[16]對(duì)紫球藻的研究結(jié)果一致。但與史磊[17]的研究結(jié)果不同，這種差異主要與實(shí)驗(yàn)藻種、培養(yǎng)基硝酸鈉濃度和培養(yǎng)條件有關(guān)，史磊[17]實(shí)驗(yàn)所用紫球藻由其所在單位提供，培養(yǎng)基硝酸鈉濃度為3.225 g/L，在恒溫振蕩光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d；而本實(shí)驗(yàn)所用藻種來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)，培養(yǎng)基硝酸鈉濃度為74.8 mg/L，連續(xù)充氣培養(yǎng)10 d。但是，以氯化銨為氮源培養(yǎng)2種微藻以獲取胞外多糖時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)較慢且生物量較低，以脲為氮源時(shí)，2種微藻的胞外多糖含量與氯化銨處理組無(wú)顯著差異，而且藻細(xì)胞生長(zhǎng)較好，加之脲的價(jià)格實(shí)惠，可以降低生產(chǎn)成本，綜合考慮生物量、胞外多糖含量以及生產(chǎn)成本，本文認(rèn)為通過(guò)培養(yǎng)紫球藻和藍(lán)隱藻以獲取胞外多糖時(shí)，脲是較為理想的氮源。肖華山等[18]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中以硝酸鈉和硝酸鉀為氮源時(shí)，紫球藻可以合成大量藻膽蛋白，反之則分泌大量胞外多糖。本實(shí)驗(yàn)也得出了相同的結(jié)果，即紫球藻2個(gè)硝酸鹽處理組的藻膽蛋白含量顯著高于氯化銨處理組，藍(lán)隱藻2個(gè)硝酸鹽處理組的藻膽蛋白含量顯著高于脲和氯化銨處理組，說(shuō)明紫球藻和藍(lán)隱藻以硝酸鹽為氮源時(shí)可以促進(jìn)藻膽蛋白合成，但會(huì)抑制胞外多糖分泌。王長(zhǎng)海等[21]認(rèn)為當(dāng)紫球藻培養(yǎng)液中缺乏硝酸鹽時(shí)，蛋白質(zhì)合成受到抑制，大多數(shù)碳化物轉(zhuǎn)化為多糖，因此蛋白質(zhì)含量下降，多糖含量上升，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜合考慮2種微藻的光合活性、生長(zhǎng)、生物量以及藻膽蛋白含量，認(rèn)為硝酸鈉是獲取2種微藻藻膽蛋白的較理想氮源。綜上所述，氮源對(duì)紫球藻和藍(lán)隱藻的胞外多糖和藻膽蛋白含量有顯著影響，可以根據(jù)所需的活性物質(zhì)選擇合適的氮源，以滿足對(duì)這2種微藻開(kāi)發(fā)利用的需要。

4 結(jié)語(yǔ)

不同氮源對(duì)紫球藻和藍(lán)隱藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度、干重、胞外多糖和藻膽蛋白含量均有顯著影響。以硝酸鈉為氮源有利于2種微藻的生長(zhǎng)和光合作用，以氯化銨為氮源則抑制2種微藻的生長(zhǎng)和光合作用；有利于紫球藻分泌胞外多糖和合成藻膽蛋白的最佳氮源分別是氯化銨和硝酸銨；有利于藍(lán)隱藻分泌胞外多糖和合成藻膽蛋白的最佳氮源分別是脲和硝酸銨。綜合考慮光合活性、生長(zhǎng)、生物量和活性物質(zhì)含量，本文認(rèn)為，獲取2種微藻胞外多糖的較理想氮源是脲，獲取2種微藻藻膽蛋白的較理想氮源是硝酸鈉。