丁莉莉，王 昊，潘志輝，張 潔，趙國忠

(1.食品生物技術教育部工程研究中心，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.廣州致美齋食品有限公司，廣州510403；3.天津市食品安全檢測技術研究院，天津300308)

醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，輔以面粉、小麥、麩皮等淀粉質原料，經過微生物發(fā)酵作用生產出的一種含有多種氨基酸且具有特殊色、香、味的調味品[1].在發(fā)酵過程中，根據醬油的發(fā)酵程序和色澤，將醬油細分為頭抽醬油和生抽醬油[2-3].頭抽醬油即是發(fā)酵后頭一遍曬成的豉油，是指醬醪完全成熟后，將這些曬制成熟的原汁醬醪首次提煉出來的豉油[4].頭抽醬油中不僅氨基酸含量高，含有豆類許多原有的營養(yǎng)成分，而且還具有極好的香氣和滋味[5].生抽醬油是將曬制成熟的原汁醬油或二抽油(第二次復釀抽取的油)、三抽油(第三次復釀抽取的油)混合調配煮制成為成品醬油.生抽醬油味道鮮美、豉香濃郁、口感醇厚，具有開胃消食的功效[6].目前，在所有市售醬油中已分析出300 多種成分，主要包括醇類、酯類、酸類、醛類、酚類、呋喃類、吡嗪類等揮發(fā)性成分[7-8]，但針對頭抽醬油和生抽醬油中的低揮發(fā)性呈香組分的比較分析研究甚少.

液液萃取法(liquid-liquid extraction，LLE)即直接溶劑萃取法，是最常用、最經典的有機化合物提取方法，這種方法是利用樣品中不同組分在兩種不相混溶的溶劑中溶解度或分配比的不同，達到分離、提取或純化的目的[9-12].液液萃取技術不僅處理的樣本量大，易于獲得一些含量微小但可能對風味影響更大的化合物，還可以通過液體進樣，收集到低揮發(fā)性的呈香組分.液液萃取法與頂空固相吸附法相比，雖然頂空固相吸附法對樣品前處理要求簡單，但其只能萃取出樣品中較易揮發(fā)的風味物質，由于頂空固相吸附法易受周圍實驗環(huán)境的影響，故不能精確地反映出樣品中風味物質的真實含量.因此，本文通過對液液萃取條件的優(yōu)化，探索出一種適合醬油中呈香組分快速和高效分離的前處理方法.

1 材料與方法

1.1 材料

2-辛醇(純度99%)，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷均為色譜純，無水硫酸鈉為分析純，天津泰艾瑞科技有限公司.市售的兩款頭抽醬油和生抽醬油.

GC/MS 2010 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，配置分流/不分流進樣口和四級桿質量分析器，日本島津公司；RCT 磁力攪拌器，德國依佧IKA 公司，旋轉蒸發(fā)濃縮裝置、氮吹儀裝置，鄭州長城科工貿有限公司.

1.2 樣品前處理方法

取 50 mL 醬油加入一定量的萃取溶劑和30μL(200.5 mg/L)的2-辛醇甲醇溶液作為內標于250 mL 碘量瓶內，加入磁力攪拌子，30 ℃水浴攪拌提取一定時間后，3 000 r/min 離心15 min.取上清醬油樣重復提取一次，合并提取液，加入無水硫酸鈉于-20 ℃冷凍過夜除水后，60 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至約2.0～3.0 mL，過0.22μm 有機濾膜到分析瓶中，氮吹濃縮至1.0 mL，待進行GC/MS 分析.

1.3 儀器條件

色譜條件：BR-SWax 色譜柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)，載氣為He，流量1 mL/min，分流比10﹕1.樣口溫度和柱箱升溫程序為：進樣口溫度250 ℃，初始溫度為40 ℃，保持3 min；然后以4 ℃/min 升至150 ℃，保持2 min；再以8 ℃/min 升至250 ℃，保持6 min.

質譜條件：EI 源(70 eV)，離子源溫度 220 ℃，傳輸線溫度 280 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍m/z為40～500.

1.4 數(shù)據處理

定性分析：呈香組分的鑒定根據 NIST11 數(shù)據庫進行檢索分析確定，參考相關文獻和譜庫初步鑒定物質成分，結合保留時間和定性離子進行準確定性，相似度在75 以上的化合物，被認為是可識別物質.

定量分析：本章采用面積歸一法確定呈香組分的相對含量及內標法(2-辛醇為內標，響應因子＝1)對醬油中呈香物質進行半定量分析.每個樣品平行測定3 次，取其平均值進行后續(xù)分析.

2 結果與分析

2.1 液液萃取法條件優(yōu)化

以頭抽醬油為研究對象，對液液萃取法的條件進行優(yōu)化.

2.1.1 不同溶劑對提取醬油中呈香組分的影響

本實驗選取極性有一定差異的乙酸乙酯(極性指數(shù)4.3)、二氯甲烷(極性指數(shù)3.4)和正己烷(極性指數(shù)0.06)作為研究對象[13-14]，料液比為1∶2，萃取時間為30 min，參照1.2 節(jié)方法，對比GC/MS 分析，結果如圖1 所示.由圖1 可知：從乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷萃取液中分別分析鑒定出66 種、74 種和58種呈香物質，且二氯甲烷萃取物所鑒定出物質的總峰面積約為6.2×109，乙酸乙酯萃取物所鑒定出物質的總峰面積約為4.9×109，正己烷萃取物所鑒定出物質的總峰面積約為4.0×109.二氯甲烷萃取物所得峰面積總和約是正己烷萃取物的1.6 倍，正己烷的萃取效率較低，這可能與醬油呈香體系的復雜性及其呈香組分多偏向于極性物質有關，弱極性的正己烷不適合用作醬油的萃取溶劑，乙酸乙酯雖然對醬油呈香組分有一定的萃取效果，因其是醬油中的一種重要的呈香組分，故不適合作為萃取溶劑.綜上考慮，選取二氯甲烷為最佳提取溶劑.

圖1 不同溶劑提取結果比較Fig.1 Comparison of extraction results with different solvents

2.1.2 不同料液比對提取醬油中呈香組分的影響

以二氯甲烷作為萃取劑，對料液比按體積1﹕1.0、1﹕1.5、1﹕2.0 進行優(yōu)化，即取50 mL 醬油分別加入50、75、100 mL 二氯甲烷進行提取，萃取時間為30 min，參照1.2 節(jié)方法，對比GC/MS 分析結果，如圖2 所示.

圖 2 不同料液比提取結果比較Fig.2 Comparison of extraction results with different solid-liquid ratios

由圖2 可知：在3 個不同料液比例的條件分別萃取出60 種、76 種和66 種呈香組分，呈香酯類、酮類、酚類和醇類均在料液比為1﹕1.5 時萃取物總數(shù)最多.當料液比為1﹕1.0 和1﹕2.0 時，對呈香組分的提取數(shù)量較低，提取效果較差，原因是當料液比為1﹕1.0 時，由于萃取劑用量與醬油用量相等，使整體溶液體積空間偏小，則醬油中的呈香組分不能與萃取劑充分接觸，提取效果不完全；當料液比為1﹕2.0時，萃取劑的用量遠大于醬油的用量，稀釋了醬油樣品，從而引起醬油中呈香物質提取效率的顯著降低.綜合考慮到萃取溶劑的用量和提取效率，故選取料液比為1﹕1.5 時作為最佳配比.

2.1.3 不同萃取時間對提取醬油中呈香組分的影響

以二氯甲烷作為萃取劑，料液比為1﹕1.5 對攪拌萃取時間進行優(yōu)化，參照1.2 節(jié)方法，對比GC/MS分析結果，該次實驗通過比較分析已確定的8 種主要呈香組分(糠醇、異丁酸、乳酸乙酯、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)呋喃酮(HEMF)、愈創(chuàng)木酚、麥芽酚和異戊醇)的相對含量篩選最佳攪拌萃取時間，結果如圖3所示.

圖3 不同萃取時間提取結果比較Fig.3 Comparison of extraction results with different extraction time

由圖3 可知：8 種主要呈香組分隨著攪拌萃取時間的延長其相對含量均有降低的趨勢，乳酸乙酯表現(xiàn)較為明顯.當萃取時間為20 min 時，相對分子質量較小的呈香組分更易萃取，但萃取不充分；當萃取時間為40 min 時，雖然對相對分子質量較大的呈香組分提取效率較高，但由于萃取時間過長，降低了對相對分子質量較小的呈香組分的提取效率，因此在該萃取時間下不能準確萃取出醬油中的呈香組分；當萃取時間為30 min 時，萃取物的相對含量明顯高于其余兩個萃取條件.綜合考慮萃取時長和萃取效率，故選取攪拌萃取30 min 為最佳萃取時間.

2.1.4 正交實驗優(yōu)化萃取條件結果

基于單因素條件優(yōu)化的最佳萃取條件下，以萃取溶劑(A)、料液比(B)、萃取時間(C)設計正交實驗，根據GC/MS 鑒定出的呈香物質總數(shù)(Y)為依據，對比分析結果見表1.

根據正交實驗結果，用極差分析法對表中數(shù)據進行分析：從極差大小看出各萃取條件對呈香組分提取影響的程度為萃取溶劑＞料液比＞萃取時間；通過不同的均值得出當萃取條件為 A2B2C2時對醬油中的呈香組分提取效果最好，即選擇用二氯甲烷為萃取劑，料液比為1﹕1.5，萃取時間為30 min 時得到的實驗結果最佳.在最佳提取條件下進行驗證實驗，GC/MS鑒定出的呈香物質總數(shù)為79 種.

表1 正交實驗設計及其結果Tab.1 Orthogonal experimental design and its results

2.2 頭抽醬油和生抽醬油中呈香組分結果分析

按照本文確定的樣品最優(yōu)前處理方法，分別對頭抽醬油和生抽醬油中的呈香組分進行分析，頭抽醬油和生抽醬油中呈香組分的總離子流圖對比結果如圖4 所示.

圖4 兩種醬油呈香組分的總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of fragrant components in two kinds of soy sauce

通過面積歸一化法求得每種呈香組分的峰面積百分比，進而根據內標法(2-辛醇為內標，響應因子＝1)計算出呈香組分的物質含量，兩款醬油中呈香組分的物質含量分析結果見表2，兩款醬油中呈香組分的物質種類總數(shù)及其相對含量見表3.

表2 兩款醬油中呈香組分的物質含量分析結果Tab.2 Analysis results of aromatic components in two kinds of soy sauce

續(xù)表

續(xù)表

表3 兩款醬油中呈香組分的物質種類總數(shù)及其相對含量Tab.3 Total number and relative content of aromatic components in two kinds of soy sauce

由表2 和表3 可知：在本實驗優(yōu)化的液液萃取條件下，頭抽醬油中共提取出79 種呈香組分，酯類的種類最多為 22 種，酸類的相對含量最高，為28.04%；在生抽醬油中共提取出94 種呈香組分，酯類的種類最多為30 種，醇類的相對含量最高，為39.45%.

2.3 頭抽醬油和生抽醬油中呈香組分比較分析

2.3.1 醇類化合物分析

醇類化合物是生抽醬油中含量最高的化合物，占據最主要的成分，含量較高的是1，3-辛二醇、1，3-丁二醇和異戊醇，分別為2 345、1 477.5、1 135 mg/L，其中1，3-辛二醇、1，3-丁二醇是生抽醬油特有醇類物質；頭抽醬油中含量較高的是3-甲基-2-戊醇、(S)-(+)-1，3-丁二醇和糠醇，其中3-甲基-2-戊醇、(S)-(+)-1，3-丁二醇是其特有成分.醇類貢獻出一定的花香和果香，尤以苯乙醇貢獻最大[15]，其在生抽醬油中的含量約是頭抽醬油的34.5 倍，因此生抽醬油多呈現(xiàn)出較為溫和的果香氣息.

2.3.2 酸類化合物分析

酸類化合物是頭抽醬油中含量最高的化合物，也是其最主要的成分.兩款醬油中共有且含量相對較高的成分有醋酸、棕櫚酸、異丁酸和亞油酸，但其兩者含量差異較大.頭抽醬油中異丁酸含量最高，為1 915.00 mg/L，占比7.66%，而在生抽醬油中僅占比1.63%；頭抽醬油中的亞油酸含量是生抽醬油中的26倍.生抽醬油中還檢測到異戊酸、DL-焦谷氨酸、硬脂酸和正癸酸，而在頭抽醬油中均未檢出；在未對樣品進行衍生化處理的條件下，兩款醬油共檢測出一種氨基酸，僅在頭抽醬油中含有，為D-丙氨酸.

2.3.3 酚類化合物分析

兩款醬油中的酚類化合物總數(shù)幾乎相當，且含量差異較小，兩款醬油中含量差異較為明顯的為2，6-二甲氧基苯酚和愈創(chuàng)木酚，在生抽醬油中2，6-二甲氧基苯酚含量最高，為1 057.5 mg/L，約為頭抽醬油的10.6 倍，貢獻出一定的甜香、木香和煙熏香；愈創(chuàng)木酚在頭抽醬油中的相對含量為4.32%，約是生抽含量的5.3 倍，貢獻給頭抽特有的焦糖香和煙熏香[16].3，5-二叔丁基苯酚和2-甲氧基對苯二酚是區(qū)分兩款醬油的特有物質，僅在生抽醬油中存在.

2.3.4 酯類化合物分析

酯類化合物是生抽醬油種類最多的化合物，但其總含量相對較低，僅為9.58%，低于頭抽醬油所占比例.頭抽醬油的酯類總數(shù)有22 種，其含量最高的是4-羥基丁酸甲酯，為2 342.5 mg/L，在生抽醬油中未檢測到該物質，是頭抽醬油的典型呈香組分，貢獻出特有的酯香和醬香，其余酯類含量較低.生抽醬油中乙酸甲酯的含量相對較高，在頭抽醬油中未檢測到該物質，是生抽醬油的典型呈香組分，貢獻給生抽醬油特有的果香和酒香.

2.3.5 酮類化合物分析

酮類化合物包括呋喃酮和吡喃酮等，呈現(xiàn)給醬油一定的果香、甜香和焦糖香[17].在兩款醬油中其含量差異表現(xiàn)較大，但種類幾乎接近，3-甲氧基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、HEMF 和3-羥基-2-丁酮在生抽醬油中含量較高，HDMF、HEMF 和2-吡咯烷酮在頭抽醬油中含量較高，對HEMF 而言，在生抽醬油中的含量是頭抽醬油的1.44 倍.

2.3.6 其他化合物分析

醛類和糖類化合物僅在生抽中檢測到，是其獨有的呈香成分，賦予生抽醬油特別的果香和甜香；吡嗪類化合物在頭抽醬油中含量與種類均多于生抽醬油，主要提供頭抽相應的堅果香、煙熏香和焙烤香，增添其濃郁的醬香風味[18].其他類化合物在頭抽醬油中的含量明顯高于生抽醬油，其中甲苯和2-乙酰基吡咯的含量在兩款醬油中較為突出，含硫化合物2，3-二氫噻吩和二乙烯基硫醚在頭抽醬油中的含量相對較高，推測含硫氨基酸的降解作用在頭抽醬油中占據一定的比重.

3 結 語

本實驗得到了一種對醬油呈香組分提取快速、分離高效、濃縮效果好且重現(xiàn)性好的最佳液液萃取前處理條件：選擇用二氯甲烷為萃取劑，料液比為1﹕1.5，萃取時間為 30 min.在最佳萃取條件下利用LLE-GC/MS 法分別從頭抽醬油和生抽醬油中檢測出79 種和94 種呈香組分.經過進一步分析比較，發(fā)現(xiàn)兩款醬油的呈香組分差異較大.頭抽醬油中的主要呈香組分是酸類，占總含量的28.04%；頭抽醬油中含量較高的為4-羥基丁酸甲酯、異丁酸和3-甲基-2-戊醇；D-丙氨酸僅在頭抽醬油中檢出.醇類化合物是生抽醬油的最主要呈香組分，相對含量為39.45%；生抽醬油中含量較高的為1，3-辛二醇、1，3-丁二醇和醋酸；醛類和糖類物質僅在生抽醬油中檢出.如果通過大量的樣本分析，可以進一步探討研究不同種類的頭抽與生抽醬油之間的成分差異，通過這種差異建立醬油的指紋圖譜，作為醬油質量標準的有益補充，并且有可能為真假醬油的辨別提供科學依據.