褚凱文，宋海巖，王金曉，張翠英，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

面包酵母在面包生產(chǎn)過程中起著生物膨松、面筋擴(kuò)展、增加風(fēng)味等作用，是最重要的微生物發(fā)酵劑和生物疏松劑[1-3].麥芽糖是不加糖面團(tuán)中最豐富的可發(fā)酵性糖，麥芽糖代謝能力是影響面團(tuán)發(fā)酵能力的關(guān)鍵因素[4]，而麥芽糖酶是麥芽糖代謝的關(guān)鍵酶[5-7].研究[8]發(fā)現(xiàn)在面包酵母發(fā)酵過程中存在葡萄糖對麥芽糖酶的產(chǎn)物抑制作用.

麥芽糖酶又稱α-葡萄糖苷酶，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)可將其歸為α-葡萄糖苷酶Ⅰ家族，屬于GH-13，含有α-淀粉酶催化部位的氨基酸的4 個(gè)保守部位[9].Yao等[10]通過研究麥芽糖、異麥芽糖及α，α-海藻糖對麥芽糖酶的抑制作用，得出在麥芽糖酶上至少存在3 個(gè)不同的單糖結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)論.麥芽糖酶的親核位點(diǎn)和水解位點(diǎn)已經(jīng)被確認(rèn)為Asp214 和Glu276，并且編碼麥芽糖酶第13—582 氨基酸編碼海藻糖treC 基因[11]，在第511—562 氨基酸位點(diǎn)存在麥芽糖酶的末端結(jié)構(gòu)域.另外，Yamamoto 等[12]通過定點(diǎn)突變技術(shù)研究來自釀酒酵母中的α-麥芽糖苷酶(麥芽糖酶和異麥芽糖酶)的底物特異性，發(fā)現(xiàn)α-麥芽糖苷酶保守序列Ⅱ中Val216 對識別α-1，4-和α-1，6-型底物起著十分重要的作用.因此，對麥芽糖酶基因MAL62 的截?cái)啾磉_(dá)，研究對面包酵母不加糖面團(tuán)發(fā)酵性能的影響，對探究編碼麥芽糖酶的氨基酸與該酶的催化功能之間的關(guān)系有重要意義.

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)麥芽糖酶不同的催化位點(diǎn)過表達(dá)部分麥芽糖酶基因，比較重組菌株之間在發(fā)酵力、麥芽糖消耗速率及麥芽糖酶活力的差異，進(jìn)而探究編碼麥芽糖酶的氨基酸與其功能之間的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

面包酵母工業(yè)菌株BY-14 由本實(shí)驗(yàn)室保藏；600-1B 是只含有MAL1 基因座中的MAL12 基因的面包酵母菌株，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；600-1BΔ12 是敲除MAL12 的面包酵母600-1B，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建.

表達(dá)質(zhì)粒Yep-PGK 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；質(zhì)粒Yep-PKM 由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 細(xì)菌培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH 7.0.

YEPD 酵母培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20.

糖蜜培養(yǎng)基(g/L)：將30～35 Brix 的糖蜜稀釋至10～12 Brix，添加酵母粉5、硫酸銨0.5，pH 5.0.

LSMLD 液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基：

(1)麥芽糖LSMLD(g/L)：麥芽糖9.5，硫酸銨2.5，尿素5，磷酸二氫鉀16，磷酸氫二鈉5，硫酸鎂0.6，煙酸0.022 5，泛酸0.005，維生素B10.002 5，維生素B60.001 25，維生素B20.001，葉酸0.000 5，蒸餾水配制.

(2)混合糖LSMLD(g/L)：麥芽糖9.5，葡萄糖3.5，其他成分與(1)相同.

1.1.3 儀器與設(shè)備

DYYⅢ2 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；PCT-200 型PCR 基因擴(kuò)增儀，美國Bio-Rad 公司；全自動凝膠成像儀，美國Syngene 公司；發(fā)酵力測定儀，瑞典SIA 公司；1100 系列高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 引物

實(shí)驗(yàn)室所用引物見表1.

表1 突變菌株構(gòu)建所需引物Tab.1 Primers used in constructing the recombined strain

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以面包酵母BY-14a 基因組為模板，用引物Yep-PKM1-410-U 和 Yep-PKM1-410-D 擴(kuò)增出目的基因M1-410，將M1-410插入到Y(jié)ep-PGK 質(zhì)粒的XhoⅠ酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒Yep-PM1-410；以質(zhì)粒pUG6 為模板，以 KanMX-U 和 KanMX-D 為引物，擴(kuò)增出KanMX 抗性基因片段.將 KanMX 片段插入到Y(jié)ep-PM1-410質(zhì)粒的SphⅠ酶切位點(diǎn)，得到質(zhì)粒Yep-PKM1-410，其構(gòu)建流程如圖1 所示.

質(zhì)粒Yep-PKM1-510和質(zhì)粒Yep-PKM13-584的構(gòu)建方法同上.

圖1 重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410 的構(gòu)建流程Fig.1 Construction of recombinant plasmid Yep-PKM1-410

1.2.3 發(fā)酵力的計(jì)算

稱取利達(dá)面粉140 g，置于30 ℃恒溫箱保溫1～2 h，稱取4.5 g 鮮酵母、2.0 g NaCl，分別加入30 mL和45 mL 的30 ℃水于鮮酵母和NaCl 中，攪拌溶解后，混合均勻倒入面粉中，快速揉和成面團(tuán)，揉面時(shí)間控制在5 min 內(nèi)，面團(tuán)溫度為(30±0.2)℃.將面團(tuán)放入發(fā)酵測定儀的不銹鋼盒中，送入活力室內(nèi)，發(fā)酵溫度為(30±0.5)℃.調(diào)節(jié)記錄儀零點(diǎn)，關(guān)閉放氣小孔，記錄產(chǎn)氣量.根據(jù)CO2產(chǎn)氣量計(jì)算面團(tuán)發(fā)酵力，即每小時(shí)每克干菌體產(chǎn)生CO2的體積.

1.2.4 重組菌株耗糖能力的測定

按1.2%的鮮酵母接種量將鮮酵母接入至裝有不同碳源100 mL 液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中，在30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔1 h 取1 次樣，采用高效液相色譜測定殘?zhí)呛縖13].

1.2.5 麥芽糖酶活力測定

30 ℃水浴條件下，將0.1 mL 細(xì)胞抽提液加入4.9 mL pNPG 溶液(1 mg/mL)，開始計(jì)時(shí)，20 min 內(nèi)每隔 5 min 快速取出 1 mL 反應(yīng)液加入裝有 1 mL 0.1 mol/L 碳酸鈉溶液的試管內(nèi)終止反應(yīng)，測定該反應(yīng)液所生成的對硝基苯酚在410 nm 下的吸光度；細(xì)胞抽提液中的總蛋白含量采用Bradford(考馬斯亮藍(lán)法)[14]測定(使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的M2031 型考馬斯亮藍(lán)法蛋白測定試劑盒)；每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值作為結(jié)果；麥芽糖酶活力單位為在30 ℃下每分鐘每毫克蛋白釋放對硝基苯酚的物質(zhì)的量[15]，即每分鐘每毫克蛋白釋放對硝基苯酚的物質(zhì)的量.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410的構(gòu)建

參照 1.2.2 節(jié)質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建質(zhì)粒 Yep-PKM1-410.分別對重組質(zhì)粒 Yep-PM1-410和 Yep-PKM1-410進(jìn)行PCR 及酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2 所示.以重組質(zhì)粒Yep-PM1-410為模板，以Yep-PKM1-410-U 和Yep-PKM1-410-D 為引物，PCR 擴(kuò)增編碼M1-410的基因片段，可得到大小為1 233 bp 的片段；對重組質(zhì)粒Yep-PM1-410進(jìn)行SphⅠ單酶切可得到8 185 bp 的片段；重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410進(jìn)行SphⅠ單酶切，可得到大小為8 185 bp 和1 613 bp 的片段，電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果均一致，證明重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410構(gòu)建成功.測序結(jié)果顯示啟動子與目的基因的方向一致，序列正確，進(jìn)一步證明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖2 重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410 的驗(yàn)證Fig.2 Verification of recombinant plasmid Yep-PKM1-410

2.1.2 重組質(zhì)粒Yep-PKM1-510的構(gòu)建

重組質(zhì)粒Yep-PM1-510和Yep-PKM1-510的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖3 所示.以重組質(zhì)粒Yep-PM1-510為模板，以Yep-PKM1-510-U 和Yep-PKM1-510-D 為引物，PCR擴(kuò)增編碼M1-510的基因片段，可得到大小為1 533 bp的片段；對重組質(zhì)粒Yep-PM1-510進(jìn)行SphⅠ單酶切可得到8 485 bp 的片段；對重組質(zhì)粒Yep-PKM1-510進(jìn)行SphⅠ單酶切，可得到大小為8 485 bp 和1 613 bp的片段，電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果均一致，證明重組質(zhì)粒Yep-PKM1-510構(gòu)建成功.測序結(jié)果顯示啟動子與目的基因的方向一致，序列正確，進(jìn)一步證明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖3 重組質(zhì)粒Yep-PKM1-510 的驗(yàn)證Fig.3 Verification of recombinant plasmid Yep-PKM1-510

2.1.3 重組質(zhì)粒Yep-PKM13-584的構(gòu)建

重組質(zhì)粒Yep-PM13-584和Yep-PKM13-584的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖4 所示.

圖4 重組質(zhì)粒Yep-PKM13-584 的驗(yàn)證Fig.4 Verification of recombinant plasmid Yep-PKM13-584

以重組質(zhì)粒 Yep-PM13-584為模板，以 Yep-PKM13-584-U 和Yep-PKM13-584-D 為引物，PCR 擴(kuò)增M13-584基因，可得到大小為1 722 bp 的片段；對重組質(zhì)粒Yep-PM13-584進(jìn)行SphⅠ單酶切可得到8 674 bp的片段；對重組質(zhì)粒Yep-PKM13-584進(jìn)行SphⅠ單酶切驗(yàn)證，可得到大小為8 674 bp 和1 613 bp 的片段，電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果均一致，證明重組質(zhì)粒Yep-PKM13-584構(gòu)建成功.測序結(jié)果顯示啟動子與目的基因的方向一致，序列正確，進(jìn)一步證明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.2 重組菌株的構(gòu)建

2.2.1 重組菌株600-1BΔ12-PKM1-410的PCR 驗(yàn)證

以重組菌株600-1BΔ12-PKM1-410的酵母質(zhì)粒和構(gòu)建的重組質(zhì)粒Yep-PKM1-410(陽性對照)為模板，用引物PGK-U 和Yep-PKM1-410-D 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，獲得2 條大小同為2 733 bp 的片段(圖5).由圖5 可以看出PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物單一，條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明過表達(dá)重組菌株600-1BΔ12-PKM1-410構(gòu)建成功.

圖5 重組菌株600-1BΔ12-PKM1-410 的PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR verification of the recombiant strain 600-1BΔ12-PKM1-410

2.2.2 重組菌株600-1BΔ12-PKM1-510的PCR 驗(yàn)證

以重組菌株600-1BΔ12-PKM1-510的酵母質(zhì)粒和構(gòu)建的重組質(zhì)粒Yep-PKM1-510(陽性對照)為模板，用引物PGK-U 和Yep-PKM1-510-D 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，獲得2 條大小同為3 033 bp 的片段(圖6).由圖6 可以看出PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物單一，條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明過表達(dá)重組菌株600-1BΔ12-PKM1-510構(gòu)建成功.

圖6 重組菌株600-1BΔ12-PKM1-510 的PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR verification of the recombiant strain 600-1BΔ12-PKM1-510

2.2.3 重組菌株600-1BΔ12-PKM13-584的PCR 驗(yàn)證

以重組菌株600-1BΔ12-PKM13-584的酵母質(zhì)粒和構(gòu)建的重組質(zhì)粒Yep-PKM13-584(陽性對照)為模板，用引物PGK-U 和Yep-PKM13-584-D 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，獲得2 條大小同為3 222 bp 的片段(圖7).由圖7 可以看出PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物單一，條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明過表達(dá)重組菌株600-1BΔ12-PKM13-584構(gòu)建成功.

2.2.4 重組菌株600-1BΔ12-PKM 的PCR 驗(yàn)證

以重組菌株600-1BΔ12-PKM 的酵母質(zhì)粒和構(gòu)建的重組質(zhì)粒Yep-PKM(陽性對照)為模板，用引物PGK-U 和Yep-PKM-D 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，獲得2 條大小同為3 255 bp 的片段(圖8).由圖8 可以看出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一，條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明過表達(dá)重組菌株600-1BΔ12-PKM 構(gòu)建成功.

圖7 重組菌株600-1BΔ12-PKM13-584 的PCR驗(yàn)證Fig.7 PCR verification of the recombiant strain 600-1BΔ12-PKM13-584

圖8 重組菌株600-1BΔ12-PKM的PCR驗(yàn)證Fig.8 PCR verification of the recombiant strain 600-1BΔ12-PKM

2.3 重組菌株與原菌發(fā)酵性能的比較

2.3.1 重組菌株與親本麥芽糖酶活力的比較

將重組菌株 600-1BΔ12-PKM1-410、600-1BΔ12-PKM1-510、600-1BΔ12-PKM13-584、600-1BΔ12-PKM 及600-1BΔ12 分別按1.2%的接種量接入至100 mL 不同碳源模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中，每隔1 h 取1 mL 發(fā)酵液，12 000 r/min 離心1 min，菌體用1 mL PBS 緩沖液懸浮，用珠磨儀將酵母菌體破碎離心收集上清液，以pNPG 為反應(yīng)底物測麥芽糖酶的酶活力.重組菌株與親本菌株的麥芽糖酶活力的比較如圖9 所示.

由圖9 可知：突變菌株的酶活力隨著時(shí)間的推移，酶活力都有逐漸增加的趨勢.與重組菌株600-1B-PKM 相比，麥芽糖酶活力提高最大是 600-1BΔ12-PKM1-410，發(fā)酵 5 h 的時(shí)候酶活力提高了17%，說明敲除催化活性區(qū)域外的氨基酸序列對麥芽糖酶活力有提高作用.

2.3.2 重組菌株與親本菌株在不加糖面團(tuán)中的發(fā)酵力比較

根據(jù)食品加工用酵母國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定改造菌株與親本菌株無糖面團(tuán)中CO2產(chǎn)氣情況，可記錄菌株發(fā)酵前1 h 釋放CO2量及發(fā)酵結(jié)束時(shí)間，并計(jì)算酵母菌體發(fā)酵力.各菌株的發(fā)酵力(以干菌體質(zhì)量計(jì))結(jié)果見表2.與原始菌600-1BΔ12 相比，各重組菌的發(fā)酵力都有明顯的提高(P＜0.05).但是，與重組菌株600-1BΔ12-PKM 相比，過表達(dá)部分麥芽糖酶基因的重組菌株的發(fā)酵力沒有顯著提高.發(fā)酵力最高的為重組菌株 600-1BΔ12-PKM1-410，與 600-1BΔ12-PKM 相比，發(fā)酵力提高了10.63%.發(fā)酵力提高的原因可能是重組菌株600-1BΔ12-PKM1-410的麥芽糖酶活力高于600-1BΔ12-PKM.這說明麥芽糖酶基因MAL62 的截?cái)啾磉_(dá)雖然使其氨基酸序列不完整，但是對菌株的發(fā)酵力并未產(chǎn)生消極影響，甚至使發(fā)酵力略微提高.

表2 無糖面團(tuán)中重組菌株及親本菌株的發(fā)酵力比較Tab.2 Fermentation ability of parent and recombiant strains in unsugared dough

2.3.3 各重組菌株與對照菌株的耗糖曲線

將菌株600-1BΔ12-PKM1-410、600-1BΔ12-PKM1-510、600-1BΔ12-PKM13-584、600-1BΔ12-PKM 及600-1BΔ12分別按1.2%的接種量接入至100 mL 不同碳源模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中，每隔1 h 取樣測定培養(yǎng)基中麥芽糖和葡萄糖含量，繪制耗糖曲線，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果.菌株在不同碳源模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中的耗糖曲線結(jié)果如圖10 和圖11 所示.

圖10 麥芽糖LSMLD 液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中重組菌株與親本菌株的耗糖曲線Fig.10 Sugar consumption curve of recombinant strain and parent strain in maltose LSMLD medium

圖11 混合糖LSMLD 液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中重組株菌株與親本菌株的耗糖曲線Fig.11 Sugar consumption curve of recombinant strain and parent strain in mixed LSMLD medium

由圖10 可以看出：在以麥芽糖為唯一碳源的模擬面團(tuán)培養(yǎng)基中，重組菌株與親本菌株的耗糖趨勢是一致的，呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢.發(fā)酵5 h 后，重組菌株中只有600-1BΔ12-PKM1-410的利用速率略優(yōu)于600-1BΔ12-PKM.由圖11 可以看出：重組菌株和親本菌株在麥芽糖和葡萄糖的混合培養(yǎng)基中消耗麥芽糖的速率都很慢，麥芽糖利用速率慢是因?yàn)橛H本600-1BΔ12 麥芽糖代謝系統(tǒng)(MAL1)被敲除.重組菌600-1BΔ12-PKM1-410利用麥芽糖的速率最快.根據(jù)圖10 計(jì)算得出：菌株600-1BΔ12-PKM 的麥芽糖利用速率為0.16 g/(L·h)，在發(fā)酵5 h 消耗了8.63%；與600-1BΔ12-PKM 相比，重組菌600-1BΔ12-PKM1-410利用麥芽糖的速率(0.21 g/(L·h))提高了31%，在發(fā)酵5 h消耗了10.84%的麥芽糖；重組菌600-1BΔ12-PKM1-510、600-1BΔ12-PKM13-584及600-1BΔ12 在發(fā)酵5 h 后麥芽糖分別消耗了8.46%、5.68%和6.70%.結(jié)果表明，重組菌600-1BΔ12-PKM1-410和重組菌600-1BΔ12-PKM1-510麥芽糖利用能力較菌株600-1BΔ12-PKM 略有提高，胞內(nèi)酶活數(shù)據(jù)表明重組菌株 600-1BΔ12-PKM1-410酶活高于600-1BΔ12-PKM，推測耗糖能力的提高主要原因是麥芽糖酶活力提高，也可能是麥芽糖酶基因MAL62 的截?cái)啾磉_(dá)減弱了葡萄糖對麥芽糖酶的抑制作用.

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)對麥芽糖酶基因MAL62 的截?cái)啾磉_(dá)，獲得了表達(dá)不同長度麥芽糖酶編碼基因的面包酵母菌株，研究了含有改造的麥芽糖酶的面包酵母菌株的發(fā)酵力、麥芽糖消耗速率及麥芽糖酶活力的變化.結(jié)果證明麥芽糖酶在含有糖苷水解酶GH13 家族的催化域第36—397 氨基酸的情況下，刪除其他部分氨基酸序列對該酶的催化活性不會產(chǎn)生消極的影響，反而會對其酶活力、發(fā)酵速度有所提升.麥芽糖酶不同截?cái)嘧凅w中600-1BΔ12-PKM1-410和600-1BΔ12-PKM1-510兩個(gè)菌株破壞了海藻糖treC 基因，使得葡萄糖與酶無法正常結(jié)合，同時(shí)這兩株菌不含有麥芽糖酶C 末端結(jié)構(gòu)域，從而減弱了葡萄糖對麥芽糖酶的抑制作用，因此這兩株菌的酶活力高于其他菌株.但是，也存在這兩個(gè)變體只是單純地提高了麥芽糖酶活力的可能，因此，還需進(jìn)一步純化該酶后分析酶活性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證.