梅義， 王真， 戴曉峰

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 無錫 214122)

CRISPR技術(shù)作為一種常見的基因編輯手段被使用于在各個(gè)領(lǐng)域中，其中對于沒有剪切活性的CRISPR-dCas9編輯系統(tǒng)的應(yīng)用同樣越來越廣泛[1-5]。例如在微生物中，有團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)在鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)了多基因的抑制[4]；在植物中，基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了多重轉(zhuǎn)錄激活或者抑制效果[6]。但是在乳腺癌研究中，關(guān)于CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的腫瘤疾病之一，也是全球女性中發(fā)病率最高的腫瘤疾病[7-8]，如果在乳腺癌研究中構(gòu)建一套簡單、高效、精確、可靠的基因編輯技術(shù)，將有利于腫瘤基礎(chǔ)研究。

2006年，Takahashi等[9]首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子OCT4、KLF4、MYC和SOX2，可以將已經(jīng)分化的細(xì)胞重新編程，使已分化的細(xì)胞回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)，得到了具有重新分化潛力與自我更新能力的多能干細(xì)胞，這4個(gè)基因誘導(dǎo)形成的多能干細(xì)胞也成了科研人員所常用的細(xì)胞模型[10-11]。在本研究中，作者通過將tRNA與sgRNA串聯(lián)組合，構(gòu)建了一套CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)，并在MCF7、SUM149PT細(xì)胞系中對OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步在基因表達(dá)、蛋白表達(dá)以及功能改變3個(gè)層次進(jìn)行檢測，以此驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定與可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系MCF7、SUM149PT來源于美國模式菌種收集中心(American Type Tissue Culture Collection，ATCC)；DMEM、F12培養(yǎng)基購于HyClone公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購于Lonsera公司；CRISPR相關(guān)編輯質(zhì)粒購于愛必夢生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購于東仁化學(xué)公司；ALDEFLUORTM試劑盒購于STEMCELL Technologies公司；超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司；GAPDH、OCT4、KLF4、MYC及SOX2抗體購于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 多基因串聯(lián)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用內(nèi)源性tRNA自剪切系統(tǒng)的原理來改造構(gòu)建多串聯(lián)sgRNA (single guide RNA)，將構(gòu)建好的多基因多sgRNA片段用BbsI單酶雙切處理后同載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接，得到4基因串聯(lián)好的目的質(zhì)粒。4基因的sgRNA序列如下：

基因sgRNA1sgRNA2OCT4GGAAAACCGGGAGACACAACGGATGTTTGCCTAATGGTGGKLF4CTCTTTCCGCCTGTTCCCGGCAGTTCACGCTGCACAGTGSOX2AAACAGCACTAAGACTACGTGCCCCCTTTCATGCAAAACCMYCAGCTAGAGTGCTCGGCTGCCGAACCCGGGAGGGGCGCTTA

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞系MCF7用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞系SUM149PT用含有5%FBS的F12培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將構(gòu)建好的CRISPR質(zhì)粒與LipofectamineTM2000按1∶3轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4 h后換新鮮培養(yǎng)基，24 h后添加200 mg/mL的G418與0.1 mg/mL的puromycin抗生素篩選。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量qPCR

將6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞用Trazol消化下來后，使用RNA提取試劑盒按步驟提取總的RNA，取1 μg提取的RNA使用反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行操作即得到cDNA，將cDNA稀釋成終濃度為10 ng/μL，按反應(yīng)布局向96孔板或八孔條中加入8 μL PCR反應(yīng)混合液，再加入2 μL模板cDNA溶液，用透明膠膜封好96孔板或用8孔條蓋封好8孔條，用Vortex震蕩混勻后離心收集溶液到管底，按PCR程序用ABI 7500運(yùn)行PCR反應(yīng)。各基因的qPCR引物如下：

基因正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)OCT4GGGAGATTGATAACTGGTGTGTTGTGTATATCCCAGGGTGATCCTCKLF4CGGACATCAACGACGTGAGGACGCCTTCAGCACGAACTSOX2GCTTAGCCTCGTCGATGAACAACCCCAAGATGCACAACTCMYCGGCTCCTGGCAAAAGGTCACTGCGTAGTTGTGCTGATGTERCAGGCATTCGGTTTGATGAGTTTGGACGAAGTACAGTTCCCGHER2TGTGACTGCCTGTCCCTACAACCAGACCATAGCACACTCGGGAPDHCCCACTCCTCCACCTTTGACATGAGGTCCACCACCCTGTT

1.2.4 Western Blot檢測

胰酶消化細(xì)胞離心后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸洗滌,加入100 μL細(xì)胞裂解液(加入1%的PMSF)吹吸混勻后放置于冰上裂解10 s左右，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，得到上清液后加入5×loading buffer，煮沸5 min，冷卻后即可上樣跑膠，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST洗滌3遍后用封閉液(TBST加5%BSA配制)室溫封閉120 min，再洗滌3遍膜，置于一抗稀釋液中過夜，再洗滌3次后置于二抗稀釋液中120 min，隨后添加顯色液上機(jī)檢測。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞鋪板于6孔板待其長滿后，吸取培養(yǎng)基，用槍頭在孔中劃直線，用PBS清洗3遍后加入含1%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在0、8、16和24 h拍照記錄。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞鋪板于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為4000個(gè)，分別在24、48及72 h后重新?lián)Q液后添加5 μL的CCK8試劑，并于37 ℃孵育2 h后置于450 nm處測定吸光度。

1.2.7 干細(xì)胞比例檢測

將細(xì)胞鋪板于6孔板中，每孔接種3×105個(gè)，待其處理后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次后用無EDTA的胰酶消化，1000 r/min，離心5 min后棄掉上清液，用PBS重懸；1000 r/min離心5 min后棄上清，添加分析緩沖液重懸細(xì)胞，制5×105cells/mL的細(xì)胞懸液，每500 μL懸液作為一個(gè)細(xì)胞樣品；分別取500 μL細(xì)胞懸液加入到兩個(gè)管子中，其中一個(gè)管子要先加入10 μL二乙氨基苯甲醛(DEAB)，然后再分別加入2.5 μL活化的氟硼二吡咯-氨基乙醛-乙酸氨基丙二酸二乙酯(BAAA)，混勻，37 ℃避光孵育30～40 min，1000 r/min，離心5 min后棄掉上清液，每個(gè)管子用500 μL分析緩沖液重懸細(xì)胞，制備好細(xì)胞樣品；將流式管低溫，避光放置使用流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建

內(nèi)切酶RNaseP與RNaseZ兩種酶可以特異性識(shí)別tRNA[12]兩端序列從而達(dá)到剪切的作用。通過設(shè)計(jì)，將OCT4、KLF4、MYC及SOX2 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的sgRNA與tRNA相連接構(gòu)建成串聯(lián)的sgRNA質(zhì)粒，再配合沒有酶切活性的C端修飾有協(xié)同激活介質(zhì)(SAM)的dCas9-SAM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)，就可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因的目的，其后通過抗生素篩選并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)即可得到基因編輯后細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過CRISPR-dCas9系統(tǒng)調(diào)控，MCF7細(xì)胞形態(tài)明顯變化，顯示出了外部形態(tài)上的差異，出現(xiàn)了多能性干細(xì)胞外部特征(圖1)。將其命名KMSO。以上結(jié)果初步揭示，CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建成功并正常工作。

圖1 串聯(lián)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

2.2qPCR與Western Blot結(jié)果分析

將MCF7、SUM149PT細(xì)胞通過CRISPR-dCas9基因編輯技術(shù)高表達(dá)OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)基因后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖2-A和圖2-B)顯示，在MCF7細(xì)胞中，4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量相對于對照組都提高至少2倍以上，其中KLF4基因的表達(dá)量更是達(dá)到16倍(P<0.001)，在SUM149PT細(xì)胞中，4個(gè)基因的表達(dá)量在基因編輯前后也發(fā)生了明顯的變化(P<0.001)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果在轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)的成功構(gòu)建。選擇MCF7細(xì)胞系進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示其蛋白表達(dá)層次與基因表達(dá)層次一致(圖2-C)，將蛋白檢測結(jié)果通過灰度值量化分析軟件統(tǒng)計(jì)后得到圖2-D，結(jié)果顯示各基因蛋白表達(dá)至少提高了2.62倍，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果在蛋白表達(dá)水平證明了CRISPR-dCas9多基因編輯技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞MCF7中可以同時(shí)調(diào)控多達(dá)4個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)了多基因編輯的目的。

2.3MCF7細(xì)胞在基因編輯后增殖、遷移和干細(xì)胞比例的變化

MCF7細(xì)胞在CRISPR-dCas9多基因編輯技術(shù)下使得OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)基因高表達(dá)。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)8、16及24 h后，其遷移能力明顯的增強(qiáng)(圖3)。通過CCK8試劑測定后發(fā)現(xiàn)KMSO細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞的存活率提高50%(圖4-A)，同時(shí)通過流式細(xì)胞儀測定被熒光標(biāo)記的乙醛脫氫酶(ALDH)的活性底物BAA(BodipyTM-aminoacetate)，結(jié)果顯示KMSO細(xì)胞的干細(xì)胞比例明顯增大，干細(xì)胞比例由2.57%增加到18.5%(圖4-B)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明CRISPR-dCas9多基因編輯技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了編輯目的，使得MCF7細(xì)胞惡性程度增大。

A：MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的檢測；B：SUM149PT細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的檢測；C：MCF7細(xì)胞蛋白水平檢測；D：MCF7細(xì)胞蛋白表達(dá)量化圖。* P ＜ 0. 05; ＊＊P ＜ 0. 01; ＊＊＊P ＜ 0. 001

圖2 重編程細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)

Figure 2 Transcription level and protein level expression in reprogrammed cells

A: MCF7與KMSO細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖；B：劃痕實(shí)驗(yàn)量化圖。* P ＜ 0. 05; ＊＊P ＜ 0. 01; ＊＊＊P ＜ 0. 001

圖3 細(xì)胞重編程對MCF7遷移能力的影響

Figure 3 Effect of cell reprogramming on MCF7 cell migration

3 討論與結(jié)論

本研究中采用了被廣泛使用的CRISPR編輯技術(shù)[1,3,5,12-13]，此項(xiàng)技術(shù)被不斷的優(yōu)化與改進(jìn)[14]并被應(yīng)用在不同的物種中。例如，Xie等利用內(nèi)源性tRNA剪切系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地切割tRNA前體的兩端，將其設(shè)計(jì)成一個(gè)簡單、通用的平臺(tái)，提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向性和多重編輯能力，并且在水稻中成功的證明了該系統(tǒng)可以指導(dǎo)Cas9編輯多個(gè)染色體靶點(diǎn)[15]。亦有報(bào)道稱將dCas9系統(tǒng)優(yōu)化后，可以在體內(nèi)精確地轉(zhuǎn)錄激活神經(jīng)系統(tǒng)中的多個(gè)基因和長鏈非編碼RNA，此技術(shù)在轉(zhuǎn)基因小鼠上得到驗(yàn)證，為科研工作提供了一個(gè)靈活、快速的篩選平臺(tái)[16]。而在乳腺癌的研究領(lǐng)域中，使用CRISPR多基因編輯系統(tǒng)的報(bào)道相對較少[17-18]，本實(shí)驗(yàn)則提供了一套標(biāo)準(zhǔn)、精確、可復(fù)制、高效的基因編輯工具，可以實(shí)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中多個(gè)基因的同時(shí)調(diào)控，為接下來的科研工作提供了基礎(chǔ)且強(qiáng)大的基因編輯平臺(tái)。

A: MCF7與KMSO對細(xì)胞增殖的影響； B：流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF7與KMSO的干細(xì)胞比例

圖4 細(xì)胞重編程對MCF7與KMSO細(xì)胞增殖和干細(xì)胞比例的影響

Figure 4 Effect of cell reprogramming on MCF7 and KMSO cell proliferation and stem cell ratio

Takaishi等人報(bào)道通過重編程OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子使得鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且發(fā)現(xiàn)了這種重編程降低了腫瘤的惡性程度[19]。而在本研究中，通過CRISPR/dCas9多基因編輯系統(tǒng)，成功在MCF7、SUM149PT細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并且使得MCF7細(xì)胞發(fā)生了分化[20]改變程度，得到了一株高分裂、高增殖及高干性的新細(xì)胞系KMSO。初步說明了不同分化程度的乳腺癌亞型之間與OCT4、KLF4、MYC及SOX2存在著一定的調(diào)控關(guān)系。這為低分化、高干性乳腺癌尋求轉(zhuǎn)化成高分化，低干性的乳腺癌而獲得有效治療提供了一個(gè)治療策略。

綜上所述，本研究通過在乳腺癌細(xì)胞系MCF7、SUM149PT中高表達(dá)OCT4、KLF4、MYC和SOX2 4個(gè)細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)錄因子，并且在基因表達(dá)、蛋白表達(dá)以及功能改變3個(gè)層次進(jìn)行驗(yàn)證，揭示了CRISPR/dCas9多基因編輯系統(tǒng)的成功構(gòu)建，為后續(xù)乳腺癌研究工作提供了基本的實(shí)驗(yàn)工具。