陸 鵬, 劉愛民

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點實驗室, 蕪湖 241000)

吡啶及其衍生物是芳香雜環(huán)類有機(jī)化合物的重要代表，是生物堿、吡哆醇、煙酰胺等輔酶的天然組成部分；也是重要的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)藥、石油、農(nóng)產(chǎn)品加工等行業(yè)，對人類經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展有著重要意義[1-2]。然而長時間的大量使用，導(dǎo)致這些吡啶類化合物不可避免的進(jìn)入土壤、水體、空氣等環(huán)境中，并長期殘留，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[3]。吡啶及其衍生物具有很強(qiáng)的揮發(fā)性、水溶性和毒性[4]，并具有致癌、致畸性，因此被美國環(huán)保署列為優(yōu)先等級污染物[5]。人體接觸后會產(chǎn)生抑郁、惡心、頭痛、肝腎損傷等不良反應(yīng)，造成嚴(yán)重的健康問題[4]。因此消除殘留的吡啶及其衍生物，修復(fù)被污染的環(huán)境是當(dāng)下亟須解決的問題。生物分解具有成本低，效率高且無二次污染等優(yōu)點，是消除環(huán)境中吡啶殘留的有效方法[6]。

2-羥基吡啶(2-HP)是一種常見的吡啶衍生物(圖1)，也是含N雜環(huán)類物質(zhì)生物分解的核心中間代謝產(chǎn)物[7-8]。多項研究表明，吡啶生物分解的關(guān)鍵步驟是形成羥基吡啶，然后再進(jìn)一步分解[9-11]。除此之外，2-HP也是尼古丁、3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)等劇毒化合物分解的中間產(chǎn)物[12-13]。因此研究2-HP的生物分解，對吡啶類污染物及相關(guān)的劇毒化合物的生物修復(fù)具有重要意義。本文從2-HP分解菌的種質(zhì)資源，代謝途徑、分解基因和關(guān)鍵酶等方面綜述其生物分解的研究進(jìn)展，并對后續(xù)研究做出展望。

圖1 吡啶及2-羥基吡啶結(jié)構(gòu)式

1 分解2-HP的微生物

微生物是2-HP自然分解的主要動力。Ensign分離到一株能以2-HP作為唯一碳源和氮源生長的細(xì)菌Arthrobactercrystallopoietes，在分解2-HP過程中，會使培養(yǎng)基產(chǎn)生藍(lán)色—紫色—橙色的顏色變化，推測這些有色物質(zhì)是2-HP分解的產(chǎn)物[14]。Houghton分離獲得一株能在含有2-HP的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌Achromobactersp. G2，該菌株可在48 h內(nèi)氧化分解濃度為1000 mg/L的2-HP，并以其為生長的唯一碳源、氮源及能量來源[15]。

Zefirov等分離到一株細(xì)菌Rhodococcusopacus，可以1.5 g/L 吡啶為唯一碳氮源生長，并在48 h對產(chǎn)生的2-HP進(jìn)一步開環(huán)分解[16]，這株細(xì)菌除了能分解2-HP外，也可以分解吡啶。Bondareva等從污染土壤中分離到3株2-HP分解細(xì)菌，可分解濃度達(dá)2000 mg/L，菌株分屬Rhodococcusrhodochrous、A.crystallopoietes兩類，其中的菌株R.rhodochrousPY11經(jīng)后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)其也具有分解吡啶的能力[17]。Semenaite等從被吡啶重度污染的土壤中分離到18株2-HP分解細(xì)菌，其中有4株可以同時利用吡啶作為碳源[18]；類似的還有菌株Arthrobactersp. KM-4，也同時具有分解吡啶和2-HP的能力[9]。這也說明了2-HP是吡啶分解的重要中間代謝產(chǎn)物。

目前已知的2-HP分解細(xì)菌，還有一部分是不能分解吡啶，或是沒有明確是否有分解吡啶能力的。如Arthrobacterpyridinolis、Arthrobacterviridescens[19]、Arthrobactersp. IN13[20]、Burkholderiasp. MAK1[21]等。Lu分離獲得的TCP分解菌Cupriavidussp. DT-1，可分解TCP產(chǎn)生2-HP，并進(jìn)一步礦化分解[13]。這一類分解菌均可以2-HP作為唯一碳源和氮源生長，并裂解吡啶環(huán)，達(dá)到礦化2-HP的目的。

2 2-HP的生物分解途徑研究進(jìn)展

第一類分解途徑為二羥基吡啶(DHP)途徑，此類途徑的共同特點是2-HP通過一個位點的羥基化，形成2,X-DHP后，隨即開環(huán)分解。Houghton等研究發(fā)現(xiàn)分解菌Achromobactersp. G2可將2-HP轉(zhuǎn)化為2,5-二羥基吡啶(2,5-DHP)，再進(jìn)一步氧化分解，生成CO2、NH3和水[15]。Cain進(jìn)一步研究菌株G2對2-HP的分解途徑，發(fā)現(xiàn)2,5-DHP是經(jīng)馬來酸途徑分解，吡啶環(huán)裂解后形成甲酸鹽和馬來酰胺酸(maleamic acid)，檢測到的終產(chǎn)物為反丁烯二酸(fumaric acid),見圖2-a[22]。在后續(xù)的研究中，Burkholderiasp. MAK1[21]、Agrobacteriumsp. DW-1[6]等多種微生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)了這條分解途徑。綜合來看，目前發(fā)現(xiàn)存在此途徑的分解菌均為革蘭氏陰性細(xì)菌。

菌株R.opacus分解2-HP，產(chǎn)生2,6-二羥基吡啶(2,6-DHP)，再進(jìn)一步開環(huán)分解為3-戊烯酸單酰胺(5-amino-5-oxo-2-pentenoic acid),具體見圖2-b。菌株A.crystallopoietes分解2-HP，會形成2,3-二羥基吡啶(2,3-DHP)，開環(huán)后檢測到的終產(chǎn)物為琥珀酸半醛(succinic semialdehyde)，具體見圖2-c[16]。

(1) 2-HP; (2) 2,5-DHP; (3) N-formylmaleamic acid; (4) maleamic acid; (5) maleic acid; (6) fumaric acid; (7) 2,6-DHP; (8) 1,3-dihydropyridine-2,6-dione; (9) 5-amino-5-oxo-2-pentenoic acid; (10) 2,3-DHP; (11) 1,4-dihydro-pyridine-2,3-dione; (12) 5-amino-2-oxo-4-pentenoic acid; (13) succinic semialdehyde

圖2 二羥基吡啶途徑[16,21]

Figure 2 Pathways of dihydroxypyridine for 2-hydroxypyridine[16,21]

第二類分解途徑為三羥基吡啶(THP)途徑。2-HP通過兩個位點的羥基化產(chǎn)生2,3,6-三羥基吡啶(2,3,6-THP)，然后再開環(huán)分解。但2,3,6-THP不穩(wěn)定，會自發(fā)的氧化聚合，生成一種藍(lán)色化合物——尼古丁藍(lán)(nicotine blue pigment)，具體見圖3-d，所以通過尼古丁藍(lán)的形成可以判斷2,3,6-THP的產(chǎn)生[23]。Nocardiasp.(PNO)分解2-HP產(chǎn)生2,5-DHP，再羥基化產(chǎn)生2,3,6-THP，然后以THP的形式進(jìn)入馬來酸途徑，生成反丁烯二酸，再轉(zhuǎn)化為丙酮酸(圖3-e)[24]。Arthrobactersp. KM-4分解2-HP，先羥基化生成2,3-DHP，再產(chǎn)生藍(lán)色化合物，最終產(chǎn)物為琥珀酸半醛(圖3-f)[9]；R.rhodochrousPY11將2-HP轉(zhuǎn)化為順式-5,6-二氫-5,6-二羥基-2-羥基吡啶[cis-5,6-dihydro-5,6-dihydroxy-2-pyridone]，再氧化為2,3,6-THP后開環(huán)分解，最終產(chǎn)物為銨離子和α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)，具體見圖3-g[8]，另外還有Arthrobactersp. IN13[20]；Arthrobactersp. PY22[18]等。這類細(xì)菌在分解2-HP的過程中，均可檢測到藍(lán)色的中間產(chǎn)物，意味著它們都以2,3,6-THP作為代謝的中間體，區(qū)別在于形成2,3,6-THP的過程不同；并且吡啶環(huán)裂解之后的反應(yīng)有所差別?？傮w來看，具有這類代謝途徑的分解菌基本都是革蘭氏陽性細(xì)菌。

圖3 三羥基吡啶途徑[8-9,24]

(1) 2-HP; (2) 2,5-DHP; (3) 2,3-DHP; (4) cis-5,6-dihydro-5,6-dihydroxy-2-pyridone; (5) 2,3,6-THP; (6) nicotine blue pigment; (7) maleamic acid; (8) maleic acid; (9) fumaric acid; (10) pyruvic acid; (11) 4-formamido-4-oxobuta-noic acid; (12) 1-hydropyrrole-2,5-dione; (13) 4-oxobut-2-enoic acid; (14) γ-butyrolactone; (15) succinic semialdehyde; (16) 2-ketoglutaramate; (17) α- ketoglutarate

3 微生物分解2-HP機(jī)制研究進(jìn)展

Tang等從菌株P(guān)seudomonasputidaS16中克隆到一個基因簇nic2，其中包含4個與2,5-DHP轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因：2,5-DHP雙加氧酶基因(hpo)、N-甲酰馬來酸酰胺去甲酰酶基因(nfo)、馬來酰胺酸脫酰胺酶基因(ami)、馬來酸異構(gòu)酶基因(iso)，編碼的酶分別催化2,5-DHP到反丁烯二酸的4步反應(yīng)[25]。菌株P(guān)seudomonasputidaKT2440中的基因nicX、nicD、nicF及nicE也具有相同的功能[26]，Yao等研究認(rèn)為，NicX和Hpo同屬一個環(huán)裂解雙加氧酶家族，該家族基因為Fe(Ⅱ)依賴型。其中Hpo和Nfo協(xié)同作用，將2,5-DHP轉(zhuǎn)化為馬來酰胺酸[7]。除此之外，菌株Ochrobactrumsp. strain SJY1中發(fā)現(xiàn)的4個基因vppE、vppF、vppG及vppH[12]；Alcaligenessp. strain P156中的naaD、naaE、naaF和naaG[27]；AlcaligenesfaecalisJQ135 中的picD、picE、picF及picG編碼的酶也都具有相同的功能，且對應(yīng)的基因之間有高度的相似性[28]。

Stanislauskiene 等用穿梭載體pRMU824Km對Arthrobactensp. PY22中的2-HP分解基因進(jìn)行篩選，獲得一個6 kb的DNA片段。序列分析表明，其中的hypB可能編碼一種單加氧酶、與hypD基因的編碼產(chǎn)物共同參與了2-HP分解之初的羥基化反應(yīng)[29]。Petkevicius利用轉(zhuǎn)座質(zhì)粒plasposon pTnMod-OKm插入突變的方法，從Burkholderiasp. MAK1中克隆到一個基因簇hpd，里面包含2-HP分解的全套基因。由hpdA、hpdB、hpdC、hpdD和hpdE5個基因構(gòu)成的基因簇編碼2-羥基-5-單加氧酶，催化反應(yīng)第一步，由2-HP生成2,5-DHP；隨后由hpdF編碼的雙加氧酶HpdF催化開環(huán)分解，通過馬來酸途徑，在HpdG、HpdH及HpdI的逐步催化下，最終生成反丁烯二酸(圖4)。各個酶與菌株P(guān).putidaS16及Ochrabactrumsp. strain SJY1中鑒定出的與馬來酸途徑反應(yīng)相關(guān)的酶功能類似，對應(yīng)的基因hpdF、hpdG、hpdH和hpdI也與該兩株菌中的4個基因具有高度相似性[30]。

圖4 菌株MAK1中Hpd對2-羥基吡啶的分解作用[30]

Vaitekunas從菌株R.rhodochrousPY11中鑒定出一個由12個基因構(gòu)成的分解2-HP的操縱子并對其中的各功能基因和表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，基因簇hpoBCDF編碼一種4組分雙加氧酶HpoBCDF，其中的HpoB、HpoC及HpoF分別與環(huán)羥基化雙加氧酶的構(gòu)成組分鐵氧還蛋白、α大亞基、鐵氧還蛋白還原酶的氨基酸序列高度相似；而HpoD與HpoC可形成復(fù)合物，故推測其是雙加氧酶系統(tǒng)的一個小亞基。HpoBCDF構(gòu)成了催化2-HP氧化的雙加氧酶系統(tǒng)，可將2-HP氧化為順式-5,6-二氫-5,6-二羥基-2-羥基吡啶。HpoE(脫氫酶)進(jìn)一步將其氧化為2,3,6-THP，再在一種新型水解酶HpoH(THP水解酶)的催化下開環(huán)形成2-酮戊二酸酰胺，隨后被HpoI(ω-酰胺酶)轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(圖5)[8]。

圖5 菌株P(guān)Y11中Hpo對2-羥基吡啶的分解作用[8]

圖6 菌株DT-1分解2-HP過程中產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)

4 討論與展望

2-HP是含N雜環(huán)類化合物的重要代表，也是長久以來存留于環(huán)境中的污染物。在各種去除污染的措施中，生物修復(fù)因其高效、安全、低成本、無二次污染等優(yōu)點而具有良好的發(fā)展前景，而對2-HP分解微生物的研究將有助于對吡啶類化合物及其衍生物污染環(huán)境的修復(fù)。在自然環(huán)境中，微生物是2-HP分解的主要驅(qū)動力，這為我們篩選相關(guān)分解細(xì)菌提供了豐富的樣本。目前已分離獲得的2-HP分解細(xì)菌主要集中在Arthrobacter、Rhodococcus、Achromobacter、Burkholderia、Ochrobactrum等幾個屬[14-21]，分解菌種屬多樣性不足，限制了生物修復(fù)研究的進(jìn)一步發(fā)展。關(guān)于分解機(jī)制方面，馬來酸途徑、α-酮戊二酸途徑等完整的代謝通路已被闡明，且相關(guān)的分解基因和酶也均被發(fā)現(xiàn)[8，30]，但尚有多條途徑的機(jī)制仍不明確。而且主要的研究仍局限于實驗室條件下，處于理論階段，尚無用于修復(fù)的相關(guān)分解菌劑和酶制劑等產(chǎn)品。

在前期的研究中，我們分離獲得的菌株Cupriavidussp. DT-1, 具有良好的2-HP的分解性能[13]，可在12 h內(nèi)完全分解濃度為500 mg/L的2-HP，與前述各分解菌相比，該菌可分解的2-HP濃度較低，雖然分解速度快，菌株活性高，并有著較高的生長速率，在生產(chǎn)分解菌劑和復(fù)合酶制劑方面具有潛在的應(yīng)用價值。且菌株在分解2-HP的過程中，發(fā)現(xiàn)有藍(lán)色代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)(圖6)，推測2,3,6-THP為中間代謝產(chǎn)物。目前已報道的形成藍(lán)色的化合物的分解菌均為革蘭氏陽性細(xì)菌，而DT-1是一株革蘭氏陰性細(xì)菌，這就為2-HP的代謝機(jī)制研究提供了新的思路，同時也說明，除了上述幾個屬的細(xì)菌外，還有其他種屬的細(xì)菌也具備2-羥基吡啶的分解能力。綜合上述研究現(xiàn)狀，今后一段時間內(nèi)2-HP生物分解的研究可以在以下幾個方面展開：1)利用宏基因組學(xué)、高通量測序等技術(shù)篩選環(huán)境中2-HP分解基因，建立分解基因種質(zhì)資源庫。2)綜合分析2-HP在微生物體內(nèi)遷移、轉(zhuǎn)化及代謝的機(jī)理。3)深入開展分解酶基因的克隆、調(diào)控機(jī)制、酶活性強(qiáng)化等研究。4)選取優(yōu)勢菌株構(gòu)建基因工程菌，增強(qiáng)菌株分解性能和環(huán)境適應(yīng)性。5)優(yōu)化發(fā)酵及分解酶純化提取方法，研究分解菌制劑及復(fù)合酶制劑的生產(chǎn)工藝。6)研究原位微生物修復(fù)的影響因素、作用機(jī)制、工藝技術(shù)和相應(yīng)的操作規(guī)程。

隨著工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，將吡啶類化合物引入環(huán)境的源頭和渠道還在擴(kuò)展，這將導(dǎo)致其污染更加嚴(yán)重，也為我們的研究帶來了新的挑戰(zhàn)。雖然控制污染源頭是解決問題的根本途徑，然而對于已經(jīng)污染的環(huán)境，開發(fā)新型高效的分解方法無疑是行之有效的措施。生物修復(fù)法憑借其自身的優(yōu)勢及潛力，將脫穎而出，成為吡啶類化合物污染環(huán)境修復(fù)的首選方法。