史客松， 馬臣杰， 馬玲玲， 曾 瑾

( 1. 寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室， 銀川 750021;2. 寧夏大學 生命科學學院， 銀川 750021)

細胞死亡是指生物細胞永久的中止執(zhí)行生理功能的狀態(tài)。細胞可能自發(fā)地出現個體程序性死亡，也可能由于疾病或創(chuàng)傷造成不可逆的損傷而死亡。而細胞死亡的方式一直是生命科學研究中的熱點，細胞在受到各種外界的刺激或在生理的自然狀態(tài)下，可以通過啟動不同的死亡途徑而進入死亡程序，進而產生不同的形態(tài)和生理結果。特別是在受到病原體感染時，宿主細胞會啟動死亡機制，以響應微生物的感染。多細胞生物最本質的免疫防御機制之一是犧牲受感染的細胞以使剩余細胞受益[1]；而另一方面，細胞死亡也可以使病原體受益，許多病原體的存活和擴散策略是誘導受感染宿主細胞死亡，細菌即可從宿主細胞逃逸，并擴散至鄰近細胞。特別是能夠在宿主細胞內侵入和繁殖的病原體，會通過多種機制來操縱宿主細胞的死亡和存活途徑，以達到在宿主機體中的生存和繁衍的目的。

1965年，在對昆蟲細胞的研究中，首次提出了細胞死亡是由一系列程序性的級聯事件組成的，細胞可以在發(fā)育期間由于病原體入侵或細胞應激和代謝紊亂而啟動程序性細胞死亡過程，從那時起對程序性細胞死亡的意義和機制進行了廣泛的研究。細胞凋亡，壞死性凋亡和細胞焦亡是近年來被普遍接受的細胞程序性死亡途徑[1]。

凋亡是程序性細胞死亡研究中第一個被廣泛研究的。在大多數情況下，細胞的凋亡是由基因調控的細胞主動死亡方式，并保持免疫沉默。相反，壞死性凋亡和焦亡則是裂解細胞的被動死亡方式，并允許釋放潛在的免疫刺激因子。多項證據表明，當這兩種細胞死亡途徑被激活時，可誘導體內炎癥反應，并且由此可以造成多種炎癥疾病的病理變化[2]。

1 細胞焦亡的發(fā)現

在細胞所具有的多種受感染后的死亡方式中，細胞凋亡可能是最早被定義并被廣泛認可的細胞死亡程序，它在機制上是由半胱氨酸依賴性天冬氨酸特異性蛋白酶或半胱天氨酸酶-3(cysteine-aspartic proteases-3，Caspase-3)和Caspase-7執(zhí)行一系列功能的。細胞中的Caspase活化后切割細胞中的PARP(poly ADP-ribose polymerase，DNA修復酶)等，導致一系列的細胞凋亡的特征，包括細胞質和核的固縮，DNA切割并維持完整的質膜，凋亡細胞的內容物被包被在膜封閉的凋亡小體中，進而被其他細胞吞噬并降解，整個過程并不伴隨炎癥的發(fā)生[3]。

Zychlinsky等[4]發(fā)現感染弗氏志賀桿菌的巨噬細胞的死亡并不依賴于Caspase-3，而是依賴于Caspase-1，但是他們沒有對此現象作出解釋。直到2001年Brennan和Cookson等發(fā)現鼠傷寒沙門氏菌感染的巨噬細胞中也出現了相似的情況，并對這種特別的程序性細胞死亡方式進行描述，提出這是一種新的死亡方式，并命名為“細胞焦亡(Pyroptosis)”[5]。Fink 等研究發(fā)現在細胞焦亡過程中，細胞質膜發(fā)生破損，內容物釋放到細胞外，進而引起炎性反應，并產生脫氧核糖核酸碎片化[6]。2009年，細胞死亡命名委員會(Nomenclature Committeeon Cell Death, NCCD)根據細胞死亡的表觀形態(tài)學，將其分為13種類型，其中就有細胞焦亡[7]。這對豐富和深入研究感染性疾病的致病機理和制訂治療策略具有重大的意義，而細胞焦亡(Pyroptosis)也成為最近幾年細胞死亡研究領域的熱點。

2 細胞焦亡的經典激活途徑和非經典激活途徑

細胞焦亡是由炎性小體引發(fā)的一種程序性細胞死亡方式，具有促使炎性因子加工成熟并分泌釋放至細胞外的特點，是先天免疫系統(tǒng)對病原體產生的重要免疫反應。目前將細胞焦亡的激活途徑分為兩種——經典激活途徑和非經典激活途徑。

2.1 細胞焦亡經典激活途徑

Martinon等提出當細胞受到某些病原體或毒素、RNA、DNA等免疫刺激物的影響后，可引起胞內模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRR)的寡聚化，組裝形成炎性復合體，含有Caspase-1的激活和募集結構域(Caspase recruitment domain, CARD)的炎癥小體直接募集pro-Caspase-1，并使2 個相鄰pro-Caspase-1發(fā)生水解，產生具有酶活性的Cleaved-Caspase-1，Cleaved-Caspase-1切割IL-1β 和IL-18 前體，并將其轉化為活性形式[8]；由于依賴Caspase-1的活化，細胞焦亡在發(fā)現之初的很長一段時間里被稱為Caspase-1介導的單核細胞死亡。 Caspase-1屬于在大多數真核生物中進化上保守的炎癥Caspase家族成員，作為一種蛋白酶，最初被認為可以將白細胞介素1β(Interleukin 1β, IL-1β)和IL-18的無活性前體進行加工成熟，從而被稱為IL-1β轉換酶(Interleukin 1β converting enzyme, ICE)；IL-1β是一種內源性熱原，可刺激發(fā)熱、白細胞組織遷移、多種細胞因子和趨化因子的表達； IL-18則誘導IFNγ的產生，對T細胞、巨噬細胞的激活很重要。 IL-1β和IL-18在一系列炎癥和自身免疫疾病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。雖然這兩種細胞因子并沒有參與到細胞死亡過程中，但它們的產生可以解釋細胞焦亡引起的炎癥反應[9]。因此，可以將由炎性小體激活、Caspase-1介導的細胞焦亡稱為經典細胞焦亡激活途徑。

2.2 細胞焦亡非經典激活途徑

Li等發(fā)現Caspase-1敲除小鼠對注射致死劑量的脂多糖(LPS)具有高度抗性[10]。有趣的是，缺乏Caspase-11的小鼠也能抵抗致命劑量的LPS注射。當致死劑量LPS注射至Caspase-11基因5-nt缺失的129型小鼠中(產生截短的Caspase-11)，檢測到IL-1β產生受阻。隨后的研究發(fā)現，Caspase-11本身可以通過CARD與LPS中脂質A部分高親和性結合識別LPS，進而觸發(fā)Caspase-11寡聚化，并使其活化；Caspase-11也可以引發(fā)小鼠巨噬細胞死亡以應對各種革蘭氏陰性菌感染。由于所引起的細胞死亡在形態(tài)上類似于Caspase-1誘導的細胞焦亡，所以這樣的細胞死亡形式被稱為非經典途徑激活的細胞焦亡。在人類細胞中的Caspase-4和Caspase-5也具有相同的功能，并且也是通過直接與LPS結合而被激活；故由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導的細胞焦亡稱為非經典細胞焦亡激活途徑。Caspase-4不僅在單核細胞中表達，而且在包括上皮細胞和角質形成細胞在內的多種非單核細胞中也發(fā)揮作用[11]。

圖1 細胞焦亡研究的發(fā)展歷程

3 細胞焦亡的關鍵效應分子——Gasdermin 蛋白

3.1 Gasdermin D蛋白

Caspase-1和Caspase-11/4/5被激活后如何執(zhí)行下游信號事件引發(fā)細胞焦亡？從1992年首次提出后的20多年，這個問題并沒有受到太多關注。直到2015年，研究發(fā)現GSDMD(Gasdermin D, GSDMD)蛋白在細胞焦亡中扮演著關鍵效應蛋白的角色[7,12]。Kayagaki課題組發(fā)現具有乙基-N-亞硝基脲誘變小鼠的骨髓巨噬細胞在LPS刺激后顯示IL-1β分泌受阻[13]。此外，GSDMD基因缺陷小鼠也可以免受致死劑量的脂多糖的影響。GSDMD在不同的組織和細胞類型中廣泛表達，支持了細胞焦亡不限于巨噬細胞的觀點[14]。近年的一些研究表明，細胞焦亡產生的主要效應分子IL-1β似乎在介導腸道炎癥中發(fā)揮著主導作用，然而腸上皮細胞(Intestinal epithelia cell,IEC)本身不產生顯著水平IL-1β，盡管在其他部位復層上皮則顯示可以在感染激活NLRP3后，產生相當量的IL-1β；在腸道中，似乎固有層吞噬細胞構成腸道炎癥IL-1β的主要來源[15]。

GSDMD名稱來自于同源小鼠基因，該基因被發(fā)現在胃腸組織和皮膚中大量表達；GSDMD在哺乳動物中高度保守，含有約480個氨基酸，分為兩個結構域，C-末端抑制結構域(RD)和N-末端效應結構域(PFD)，它們通過中間的長環(huán)相連接。Shi等研究發(fā)現僅僅GSDMD的Gasdermin -N結構域在哺乳動物細胞中的表達即可在細胞膜表面形成小孔，釋放出IL-1β，誘導細胞焦亡的發(fā)生[9]；由于Gasdermin -C結構域對Gasdermin -N的抑制性結合，使得全長的GSDMD無活性。重組Gasdermin -N也顯示出對4,5-二磷酸磷脂酰肌醇和心磷脂強烈的特異性結合[9]。有研究表明Gasdermin -N結構域對細菌也具有極高的毒性，鑒于4,5-二磷酸磷脂酰肌醇和心磷脂分別存在于哺乳動物細胞質膜和細菌內膜中，因此提出了一個假設，即Gasdermin -N結構域可以直接靶向與動物細胞和細菌的質膜結合并使其裂解[3]。至此，研究者勾畫出細胞焦亡的更詳細的過程，具體如圖2所示：當細菌、病毒和毒素等感染細胞時，細胞通過一定途徑促使炎癥小體形成，激活依賴Caspase-1 的細胞焦亡經典信號通路或依賴Caspase-4/5/11的細胞焦亡非經典信號通路，活化后的Caspase-1或Caspase-11/4/5剪切Gasdermin D，將Gasdermin D 的C-末端抑制結構域(RD)和N-末端效應結構域(PFD)分開。而PFD可在細胞膜上寡聚化，即形成原聚體(聚合度更完整的蛋白質組裝單元)，約16個原聚體可在細胞膜上組成對稱且規(guī)則的孔道，孔道的內徑大多為10～16 nm，所以細胞中直徑小于這個孔的內容物，如IL-18和IL-1β等因子就可以通過這個GSDMD孔道釋放出去，而直徑為25～30 nm的核糖體和較大的細胞器則不會通過這樣的孔道泄漏出細胞。質膜上GSDMD孔道的形成破壞了細胞內外的滲透壓，最終導致細胞膨脹溶解。而正是由于GSDMD的成孔作用，使細胞焦亡在細胞形態(tài)上出現質膜的破裂，從而與細胞凋亡和細胞壞死性凋亡有所區(qū)別[17]。Sarhan等將耶爾森氏菌毒力因子(YopJ)和一種轉化生長因子激酶1(TAK1)抑制劑作用于小鼠巨噬細胞，發(fā)現兩者均抑制了TAK1，并激活了Caspase-8，激活的Caspase-8剪切GSDMD和GSDME，從而導致細胞焦亡的發(fā)生；研究中還發(fā)現GSDMD的缺少可能延遲了質膜的破裂，從而使細胞死亡形態(tài)由焦亡回到凋亡[18]。

由此可見，Gasdermin 蛋白對于細胞焦亡發(fā)生的重要性不言而喻，所以細胞焦亡也可以理解為一種由Gasdermin 介導的程序性細胞死亡。此外，活化的GSDMD可在細菌膜上形成孔以殺死細菌，但仍需要進一步的體內功能證據來支持細菌膜上GSDMD孔的形成，進而確定GSDMD蛋白如何通過細胞壁進入細菌內膜并發(fā)揮作用。

圖2 細胞焦亡的Caspase-1依賴的經典和 Caspase-4/5/11依賴的非經典誘導激活機制Figure 2 Canonical Caspase-1-dependent and non-canonical Caspase-4/5/11-mediated pyroptosis pathways

研究表明當志賀毒素作用THP-1細胞時，除了Caspase-4被活化剪切Gasdermin D蛋白，導致細胞焦亡，剪切的Gasdermin D蛋白所形成的Gasdermin D的N端還可以導致線粒體活性氧(ROS)的增加，促成NLRP3炎性小體的組裝，進而導致pro-IL-1β的剪切，說明NLRP3可能還參與到細胞焦亡的非經典誘導途徑中[19]。所以NLRP3有可能是細胞焦亡經典誘導途徑和非經典誘導途徑的中間連接點。但是NLRP3炎性小體的具體激活機制尚不清晰，恰巧的是有研究發(fā)現不同的NLRP3刺激物可導致反式高爾基體網絡(TGN)的解體，分解后的TGN(dTGN)具有帶負電荷的磷酸脂酰肌醇-4-磷酸，而NLRP3可通過其自身保守的多堿性區(qū)域與dTGN上帶負電荷的磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns4P)發(fā)生鍵合，使NLRP3招募到dTGN中；此時dTGN充當NLRP3的支架，募集細胞凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)，以此激活Caspase-1，從而激活經典性細胞焦亡[20]。

3.2 Gasdermin 蛋白家族

Gasdermin (GSDM)家族由Gasdermin A(GSDMA)、Gasdermin B(GSDMB)、Gasdermin C(GSDMC)、Gasdermin D(GSDMD)、Gasdermin E(GSDME)和Pejvakin(PJVK)組成[21]。除PJVK外，所有GSDMs都由保守的兩個結構域組成：C-末端抑制結構域(RD)和N-末端效應結構域(PFD)，其中N-末端結構域具有細胞毒性，而全長結構則不具有細胞毒性，這表明GSDMs蛋白家族的C-末端(GSDMs-C)具有自身抑制和保護作用，而正由于C末端的存在，GSDM蛋白在未被裂解的情況下不會導致細胞死亡。而RD一旦被水解去除，其PFD便可與脂質組分結合，在細胞膜上形成孔洞[11]。目前研究發(fā)現除PJVK外，幾乎所有GSDMs的N端結構域都具有在質膜上形成孔道的能力；GSDMs中只有GSDMD誘導細胞焦亡的機制比較明確。人類基因組可編碼單個GSDMA，而小鼠基因組可編碼GSDMA1、GSDMA2和GSDMA3。小鼠不攜帶GSDMB的基因。人類有一個編碼GSDMC基因的單拷貝，而小鼠基因組中則有4個拷貝；人和小鼠中都有可編碼GSDMD、GSDME和PJVK的基因，其中小鼠中GSDMD、GSDME和PJVK各有一個同源物。研究發(fā)現GSDMA、GSDMB、GSDMC和GSDMD在食道和胃中都有所表達，GSDMA和GSDMC在皮膚中有所表達，而GSDMB、GSDMC和GSDMD都能在腸道中表達，PJVK在內耳的毛細胞和聽覺系統(tǒng)的其他細胞中有所表達[22]。目前研究發(fā)現GSDMD可由Caspase-1/4,5/11激活，GSDME可由Caspase-3激活，GSDMB可被Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7切割，其切割方式類似于GSDMD，而GSDMA、 GSDMC和PJVK還不清楚由哪些炎性Caspase家族蛋白激活，激活后的Gasdermin 蛋白的N端會在與質膜中的脂質結合并形成大的由16個原聚體組成的GSDM孔道，導致IL-1β和IL-18等炎性因子的釋放和細胞死亡(圖3)[23]。

圖3 Gasdermin蛋白家族成員在細胞焦亡中的作用[23]

研究發(fā)現 GSDMA3的表達可使Caspase-3表達上調，意味著GSDMA3可能誘導細胞凋亡。在人胚胎腎細胞293(Human embryonic kidney cells 293)細胞中，以及攜帶相同突變的小鼠GSDMA3中還可以通過自噬誘導細胞死亡，與此同時GSDMA3也可能在細胞焦亡中發(fā)揮一定的作用，但是尚未鑒定出切割人或小鼠的GSDMA蛋白酶，同時GSDMA3在質膜上成孔的機制尚不清楚[24]。

GSDMB 與質膜結合的偏好不同于其他GSDM。全長的GSDMB和N末端結構域都可以與4,5-二磷酸磷脂酰肌醇和糖脂硫苷脂結合。GSDMB與人類免疫疾病有關，但詳細的分子機制尚未清楚。最近有研究發(fā)現，GSDMB 通過直接結合Caspase-4的CARD結構域促進Caspase-4活性，此研究可能會發(fā)現一種新型的GSDMB 介導的非經典誘導途徑細胞焦亡的調節(jié)機制，并提出了治療炎性疾病的潛在新策略[25]。此外，子宮頸癌和乳腺癌患者的GSDMB表達量有所增加，也暗示GSDMB可能和這些疾病有關。

關于GSDMC的功能知之甚少，研究發(fā)現GSDMC在正常上皮細胞中不表達，但 GSDMC在惡性黑色素瘤中表達增加，而又在食管癌和胃癌中受到抑制；但是目前還沒有研究發(fā)現Gasdermin C在人和小鼠疾病中發(fā)揮作用[22]。

目前，在GSDM蛋白家族中，GSDMD誘導細胞焦亡的機制較為清楚，但是對于GSDMD在引發(fā)細胞焦亡的過程中，如何識別炎性相關的Caspase的分子機制還不是非常清楚。Rühl等人發(fā)現在GSDMD活化后，質膜重塑機制中的內體分選復合物Ⅲ會被募集到質膜，對GSDMD-N端的穿孔作用進行調整，在一定程度上會使IL-1β的分泌下調。此研究對細胞焦亡期間的細胞存活機制具有十分重要的意義[26]。

GSDMD與很多疾病有關，其中GSDMD還可以引起膿毒癥。新的研究表明，GSDMD還可以促進中性粒細胞胞外陷阱的形成，這可能為治療炎性疾病開辟新的治療途徑[27]。有趣的是，剪切后GSDMD除了會導致受感染的宿主細胞發(fā)生焦亡，同時還能殺死宿主細胞外面的細菌。這些研究都豐富了人們對GSDM家族蛋白的認識[28]。

人類GSDME在結直腸癌細胞系和原發(fā)性結直腸癌組織中被甲基化，說明GSDME可能是腫瘤抑制因子，并通過在癌細胞中誘導程序性細胞死亡而起作用。也有研究表明，GSDME與耳聾有關。Lu等研究發(fā)現GSDME在各種肺癌細胞系中都有表達，而在肺癌細胞中也發(fā)現有細胞焦亡和細胞凋亡的發(fā)生，證明了GSDME與細胞焦亡和細胞凋亡都有密切的聯系，而且可能在特定的情況下發(fā)生相互轉換[29]。同時，Wang等研究發(fā)現Caspase-3功能的喪失并沒有阻止由Caspase-7激活引起的細胞凋亡，還發(fā)現Caspase-3也能通過剪切GSDME誘導細胞凋亡，首次揭示了GSDME將化療藥物誘導的胃癌細胞中Caspase-3依賴性細胞凋亡轉化為細胞焦亡[30]。這樣證明了GSDME和癌細胞之間關系密切，也表明由GSDME誘導的細胞焦亡機制可能為抗腫瘤治療提供新的研究方向。

PJVK(也稱為DFNB59)是一種與人和小鼠聽力損傷相關的蛋白質。人類PJVK 在毛細胞、中樞神經系統(tǒng)、神經節(jié)、內耳和神經元的細胞中都有表達[31]； PJVK定位在過氧化物酶體膜上，是HepG2細胞中氧化應激誘導的過氧化物酶體增殖所必需的。而缺乏PJVK的耳蝸中的細胞會導致過氧化物酶體功能障礙和抗氧化防御能力受損。有研究表明Pejvakin基因的突變導致常染色體隱性聽力損失，也證明PJVK和聽力損傷有關。目前有研究證明了毛細胞中PJVK的丟失，會導致嚴重的聽力損失，而神經元中的PJVK基因的丟失不會導致這種情況，這說明PJVK基因在其他器官細胞中和毛細胞中的作用機制不同[31]。而PJVK所引起的聽力相關的這些生理現象是否與細胞焦亡有關，目前還未見報道。但是PJVK對于人工耳蝸的研究會有很大的幫助，同時對治療聽力損失可能是一個新的研究靶點。

4 展望

由于在正常生理條件下，GSDMs蛋白的N-端成孔結構域被C-末端結構域所抑制，只有被炎性Caspase切割活化后才會發(fā)揮作用，而完整的GSDMs對細胞維持正常的生理活動沒有影響，因此，科學家推測GSDMs蛋白作為多種疾病，特別是炎性疾病的治療靶點更為安全有效。也有一些科學家則關注GSDMs蛋白所引起的細胞焦亡可能對侵入機體中的病原體具有殺傷作用，而將GSDMs蛋白作為治療感染性疾病的切入點；隨著近年來對GSDMs蛋白家族各蛋白的深入研究，發(fā)現由其介導的細胞焦亡與多種疾病 (如腫瘤、耳聾、脫發(fā)、炎癥性腸病以及哮喘等) 有密切聯系。最近的研究發(fā)現GSDMs蛋白家族在中風中也起著重要的作用，GSDMs作為中風治療的潛在靶標具有可行性[24]。

隨著細胞焦亡的機制逐漸清晰，科學家愈加認識到它在細胞炎性程序死亡機制中的重要作用。目前細胞焦亡與傳染性疾病、慢性炎癥以及自身免疫性疾病、神經退行性疾病、心腦血管疾病、癌癥、艾滋病等都有一定的聯系。因此，對于細胞焦亡機制的研究不僅有助于我們進一步了解細胞程序性死亡的多樣性，而且為細胞焦亡所導致的相關疾病的治療和藥物開發(fā)提供新的研究靶標。