羅海玉， 吳正存， 馬開利,2

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 藥物安全性評價(jià)研究中心， 昆明 650118；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)靈長類研究中心&神經(jīng)科學(xué)中心， 北京 100005)

帕金森氏病(Parkinson′s disease，PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，65歲以上人群的發(fā)病率為1%[1]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在PD的黑質(zhì)致密部可見部分球狀包涵體，稱為路易小體(Lewy bodies，LBs)。LBs的形成可認(rèn)為是PD的病理學(xué)標(biāo)志，它的主要成分為部分中空的放射狀淀粉樣纖維，而該淀粉樣纖維的主要成分為α-突觸核蛋白(α-synuclein，AS)。AS是一種14 ku的蛋白質(zhì)，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元突觸前末梢及細(xì)胞核，它可以與脂質(zhì)結(jié)合并且調(diào)節(jié)突觸小泡的釋放，參與突觸正常功能的維持，并且與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[2]。

近年來的研究報(bào)道表明，異常聚集的AS具有類朊病毒樣的傳播特性，其原纖維會(huì)像朊病毒一樣進(jìn)入細(xì)胞造成損害，并且會(huì)在多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞間遷移，導(dǎo)致大腦中更多毒性AS的擴(kuò)散集聚，最終導(dǎo)致大腦負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)控制區(qū)域的神經(jīng)元死亡[3]。同時(shí)，相比較于PD的經(jīng)典毒素模型和轉(zhuǎn)基因模型，利用AS原纖維建立的PD動(dòng)物模型所誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性AS水平更接近于人類的生理水平[4]，并且PD的原纖維動(dòng)物模型所誘導(dǎo)產(chǎn)生的病理變化和神經(jīng)元功能障礙更類似于人類的病癥[5]。目前，AS原纖維已經(jīng)成為建立PD模型的重要材料，高效制備大量AS原纖維將為PD的研究奠定重要基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建了高效表達(dá)人AS的原核載體，通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化獲得了人α-突觸核蛋白的大量表達(dá)，采用GST融合蛋白純化磁珠法進(jìn)行蛋白的純化，同時(shí)對原纖維培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終高效獲取了重組人AS原纖維，并在透射電鏡下成功觀察到了原纖維的形態(tài)。以上結(jié)果為PD的動(dòng)物模型及細(xì)胞模型的建立提供了重要的研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1-α-syn及pGEX-5X-1載體、大腸桿菌菌株BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自寶生物(大連)公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海生工生物有限公司；GST融合蛋白純化磁珠試劑盒購自海貍公司；蛋白預(yù)染Marker購自NEB公司；鼠抗anti-α-synuclein一抗和羊抗鼠二抗購自Abcam公司；氨芐霉素、胰蛋白胨和酵母提取物(LB) 購自O(shè)xoid公司；硫磺素T試劑、全黑的384孔板購自賽默飛公司；其他常用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人AS原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的人AS序列設(shè)計(jì)引物：α-synF：5′-TTCCCGGGTATGGATGTATTCATG-3′；α-synR：5′-AAGCGGCCGCTTAGGCTTCAGGTTCG-3′。引入酶切位點(diǎn)SmaⅠ和NotⅠ，以載體pcDNA3.1-α-syn為模板獲取AS全長基因。分別用SmaⅠ和NotⅠ雙酶切pGEX-5X-1和AS PCR片段后，按試劑盒方法回收產(chǎn)物。在T4連接酶的作用下，將AS片段克隆至載體pGEX-5X-1中，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。試劑盒方法抽提重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)SmaⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定陽性的重組子送上海生工進(jìn)行測序鑒定。測序正確的陽性克隆子命名為pGEX-5X-1-syn。

1.2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的陽性克隆pGEX-5X-1-syn和PGEX-5X-1載體轉(zhuǎn)化BL21菌株后，分別挑取單菌落接種到含有終濃度為50 nmol/L氨芐霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜；再將菌液按1∶50的比例接種到含同樣濃度氨芐霉素的新鮮的100 mL 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.8左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集菌體。加入細(xì)菌裂解液充分裂解菌體后，加入5 ×上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察誘導(dǎo)結(jié)果。同時(shí)采用AS單克隆抗體進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證蛋白的表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)的可溶性分析

按上述方法誘導(dǎo)后離心收集菌體，加入細(xì)菌裂解液充分裂解，于4 ℃，13 000 r/min 離心20 min，分離上清為可溶性總蛋白，沉淀物為不溶性的包涵體。將沉淀物中加入適量的濃度為6 mol/L的尿素溶液進(jìn)行溶解，同樣方法離心取上清，得到不溶性的包涵體成分。進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白表達(dá)的可溶性。

1.2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

分別挑取單菌落接種到含有終濃度為50 nmol/L氨芐霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，分別加入終濃度為0、0.5、1.0和2.0 mmol/L的IPTG 37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h，收集菌體進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分析IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。在篩選出最佳誘導(dǎo)濃度后，按上述方法加入最佳誘導(dǎo)的IPTG后，分別于每1 h取樣，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分析IPTG的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。在篩選出最佳誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間后，按上述方法加入最佳誘導(dǎo)濃度的IPTG，分別于16 ℃、30 ℃及37 ℃條件下誘導(dǎo)，分別收集菌體進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分析IPTG的最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.5 GST融合蛋白純化

參考純化試劑盒說明書并進(jìn)行部分條件優(yōu)化：將誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白菌體100 mL 離心收集后加入30 mL Buffer A進(jìn)行超聲破碎(200 Hz，超聲破碎10 s，停15 s，工作時(shí)間為15 min)；離心后取上清加入終濃度為10 mmol/L的DTT和0.1% Tween 20，加入GST純化磁珠；4℃條件下漩渦混合1 h；磁性分離，用Buffer A分別清洗3次磁珠。洗滌完后加入適量的Buffer B進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，取適量進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳?；厥沾胖楹蟀凑f明書用Buffer C和Buffer D進(jìn)行洗滌，保存于20%的乙醇中重復(fù)利用。

1.2.6 Western Blot 檢測

將誘導(dǎo)表達(dá)蛋白和純化的人AS經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離；4 ℃ 60 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h；用1%脫脂奶粉常溫封閉1 h。加入anti-α-synuclein抗體(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入紅外熒光二抗標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶10 000)，室溫避光孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。用美國Licor的Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)掃描結(jié)果。

1.2.7 硫磺素T實(shí)驗(yàn)

使用PBS將硫磺素T原液稀釋到工作濃度為25 μmol/L，384孔板每孔加入95 μL的硫磺素T工作液，同時(shí)加入2.5 μL的樣品，上下混勻。在室溫孵育30 min，用Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測(激發(fā)波長450 nm，發(fā)射波長500 nm)。

1.2.8 透射電子顯微鏡驗(yàn)證原纖維的形成

用水將磷鎢酸試劑稀釋至1%，將原纖維溶液上下混勻后滴于事先準(zhǔn)備好的銅網(wǎng)上，靜置5 min用濾紙吸干未吸收的溶液，用尖頭鑷子夾住蘸取磷鎢酸染液，稍微干燥之后沾水以洗去多余的染液，室溫干燥30 min，在電壓100 kV的透射電鏡下觀察樣品并拍照記錄。磷鎢酸負(fù)染方法可以將背景染成黑色，所以電鏡下看到的原纖維輪廓呈現(xiàn)白色。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效表達(dá)重組人AS原核系統(tǒng)的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1-A所示，PCR 擴(kuò)增得到大小約為420 bp的單一條帶，與目的片段大小一致。PGEX-5X-1是表達(dá)GST融合蛋白的原核高效表達(dá)載體，載體本身能表達(dá)一個(gè)分子量為26 ku的GST標(biāo)簽蛋白，因此預(yù)計(jì)融合AS后其分子量大約為45 ku。采用終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)6 h，結(jié)果如圖1-B箭頭所示，誘導(dǎo)表達(dá)后菌體經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳，相比較空載體對照組，在45 ku左右處有一明顯的特異性蛋白條帶，與預(yù)期的分子量大小一致，初步證實(shí)AS得到外源表達(dá)。采用anti-α-synuclein單克隆抗體通過Western Blot方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果(圖1-C)顯示，相比較空載體轉(zhuǎn)化組，重組載體pGEX-5X-1-syn轉(zhuǎn)化組在45 ku左右處有特異性的條帶出現(xiàn)，證實(shí)融合的AS得到高效表達(dá)。對表達(dá)蛋白菌體分離菌體上清和包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果(圖1-D)表明，融合AS幾乎全部存在于菌體上清液中，顯示融合AS為可溶性表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)人AS在PGEX-5X-1載體中得到高效融合表達(dá)。

圖1 表達(dá)重組人AS原核載體系統(tǒng)的構(gòu)建

2.2 重組人AS誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

為獲取大量的重組人AS，對誘導(dǎo)劑IPTG的最佳濃度、最佳誘導(dǎo)時(shí)間及最佳誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果(圖2-A)顯示，當(dāng)存在IPTG的情況下，AS得到了大量誘導(dǎo)表達(dá)，且隨著濃度增加，AS的表達(dá)量趨于平穩(wěn)。所以本研究中采用終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。在此濃度條件下對誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別誘導(dǎo)0～6 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果(圖2-B)顯示，在誘導(dǎo)3 h時(shí)，重組人AS的表達(dá)量達(dá)到最大。因此篩選出重組人AS的最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG終濃度1.0 mmol/L；誘導(dǎo)時(shí)間3 h。對誘導(dǎo)表達(dá)的溫度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。分別采用37 ℃、16 ℃和30 ℃條件，IPTG終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3 h，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果(圖2-C)顯示，在誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，重組人AS的表達(dá)量達(dá)到最大。所以，本研究最終優(yōu)化的誘導(dǎo)條件為：終濃度為1.0 mmol/L的IPTG 37 ℃下誘導(dǎo)3 h。

A: IPTG濃度；B：誘導(dǎo)時(shí)間；C：誘導(dǎo)溫度

圖2 重組人AS誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

Figure 2 Optimized induction conditions of recombinant human AS

2.3 重組人AS純化條件的優(yōu)化

本研究使用的蛋白純化方法區(qū)別于傳統(tǒng)的親和層析方法，采用高效率的GST融合蛋白純化磁珠進(jìn)行蛋白純化，在短短3 h內(nèi)即可完成純化工作。如圖3-A所示，對純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示純化后的蛋白純度高達(dá)99%左右，測定蛋白濃度為600 ng/mL，每100 mL細(xì)菌培養(yǎng)液可純化出AS蛋白2.5 mg。同時(shí)，如圖3-B所示，對GST純化磁珠的純化效率進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)多次重復(fù)使用磁珠，對純化效率沒有明顯的影響。如圖3-C所示，采用anti-α-synuclein單克隆抗體，通過Western Blot方法對純化后的蛋白進(jìn)行鑒定，在45 ku左右處有特異性的條帶出現(xiàn)，證實(shí)純化獲得的是目的蛋白AS。以上結(jié)果證實(shí)采用GST融合蛋白純化磁珠可以重復(fù)并高效率的獲取高純度的重組AS。

圖3 采用GST融合蛋白純化磁珠進(jìn)行AS蛋白的純化

2.4 重組人AS原纖維制備條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AS的起始濃度及培養(yǎng)時(shí)間是原纖維形成的關(guān)鍵性因素。因此在37 ℃，1000 r/min震蕩培養(yǎng)的條件下，進(jìn)一步對原纖維培養(yǎng)的濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。本研究采用硫磺素T實(shí)驗(yàn)對淀粉樣蛋白原纖維的形成情況進(jìn)行檢測(激發(fā)波長450 nm，發(fā)射波長500 nm)。由圖4-A熒光結(jié)果顯示，重組人AS在濃度為9 mg/mL的條件下才能大量形成原纖維。在此濃度條件下，對原纖維形成的時(shí)間依賴性進(jìn)行了檢測(0～14 d)，結(jié)果(圖4-B)顯示，原纖維在第6天達(dá)到最高值，隨后趨于穩(wěn)定。圖4-B中的140 aggregate為商品化的AS聚集體，作為陽性對照。以上結(jié)果證實(shí)采用濃度為9 mg/mL，培養(yǎng)6 d可制備大量重組AS原纖維。

圖4 重組人AS原纖維制備條件的優(yōu)化

2.5 透射電鏡檢測重組人AS原纖維的形成

對原纖維樣品進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染后，置于銅網(wǎng)上，干燥后通過透射電鏡觀察原纖維的形態(tài)。如圖5中箭頭所示，電鏡下可以觀察到長度大于50 nm的較長的纖維結(jié)構(gòu)，圖5-A、B和C分別代表10.0、20.0和30.0 k倍數(shù)下重組人AS原纖維的電鏡結(jié)果。證實(shí)AS原纖維制備成功。

圖5 透射電鏡觀察重組人AS原纖維的形成

3 討論與結(jié)論

Volpicelli-Daley等人首先報(bào)道了外源性的AS原纖維會(huì)誘導(dǎo)路易體病變，并最終導(dǎo)致突觸功能障礙和神經(jīng)元死亡[6]。隨后，其又發(fā)現(xiàn)AS原纖維會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性的AS發(fā)生聚集并形成LBs[7]。最新研究表明，AS原纖維會(huì)優(yōu)先與線粒體結(jié)合，并最終導(dǎo)致線粒體功能障礙[8]。研究者們將AS原纖維注射到小鼠的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量類LBs的包涵體[9]；將AS原纖維接種于原代神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量包涵體并且發(fā)現(xiàn)磷酸化水平明顯升高[10]。因此，利用AS原纖維建立PD模型，將有望成為研究體內(nèi)PD樣LB病理學(xué)的通用造模方法。

AS的聚集傾向是導(dǎo)致PD的主要原因，其本質(zhì)上是一種無序的蛋白質(zhì)，但不同的環(huán)境條件會(huì)影響其構(gòu)象可塑性[11]。所以，如何高效率獲得大量純度較高的AS原纖維已經(jīng)成為各項(xiàng)研究工作的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，越來越多的研究者旨在建立一套高效的純化及制備方法。選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)、快捷的純化方法和高效的制備條件是獲取高濃度純度原纖維的關(guān)鍵。

本研究中采用pGEX系列載體中的PGEX-5X-1，pGEX系列載體是廣泛用于融合蛋白構(gòu)建和表達(dá)的載體，其所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物在N端帶有GST序列，融合蛋白產(chǎn)物可通過GST層析柱快速、簡便地純化[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人AS在PGEX-5X-1載體中得到高效可溶性表達(dá)，大大降低了純化難度。

在純化過程中，本研究采用了GST融合蛋白磁珠方法，便于控制洗脫體積，能在短短3 h內(nèi)從1 L細(xì)菌培養(yǎng)液中獲取25 mg重組蛋白，與傳統(tǒng)蛋白純化方法(沉淀技術(shù)、層析技術(shù)、雙水相萃取技術(shù))相比[13]，具有更快速、高效率、低成本和操作簡單等優(yōu)勢。同時(shí)用磁珠進(jìn)行純化，無需對粗蛋白進(jìn)行復(fù)雜的處理，能在短時(shí)間內(nèi)就完成純化工作，避免了純化過程中蛋白質(zhì)的損失。本純化方法對實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，不需要昂貴的層析設(shè)備，且GST融合蛋白純化磁珠具有能重復(fù)使用的優(yōu)良特點(diǎn)，能大大降低實(shí)驗(yàn)成本。

近年來，越來越多的研究者致力于尋找一種高效的PD模型以及監(jiān)測量化AS聚集體的轉(zhuǎn)變過程[14]，并且大量研究表明特定的誘導(dǎo)條件可以誘導(dǎo)產(chǎn)生不同形式的AS聚集體。本研究參考總結(jié)了Polinski[4]和Volpicelli-Daley[7]等人的原纖維制備方法，對重組人AS原纖維的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化和改良。發(fā)現(xiàn)在濃度為9 mg/mL的條件下，37 ℃，1000 r/min震蕩培養(yǎng)6 d時(shí)，能夠得到濃度較高的原纖維，并通過透射電鏡對制備出的原纖維的形態(tài)進(jìn)行了確證。由于原纖維聚集的隨機(jī)性和調(diào)節(jié)因子的多樣性，對原纖維形成進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測成為目前研究的難點(diǎn)之一[15]。本研究采用了目前公認(rèn)的硫磺素T檢測方法[16]對原纖維的形成進(jìn)行了連續(xù)監(jiān)測，由于硫磺素T能夠與原纖維結(jié)合并且在特定的熒光光譜下產(chǎn)生較高的熒光值，所以可以根據(jù)熒光值判斷出原纖維在不同濃度和不同時(shí)間的形成情況。本研究對原纖維的檢測重復(fù)了多次，發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致性和穩(wěn)定性都較好，反復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該方法所制備的原纖維具有很高的濃度和純度。

經(jīng)本研究大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GST融合蛋白磁珠可用于GST標(biāo)簽融合蛋白的高效純化。硫磺素T染色和電鏡觀察均證實(shí)該制備方法獲取了高濃度和高純度的AS原纖維。本研究得出一套成本較低、濃度純度較高、制備穩(wěn)定性和重復(fù)性較高的AS原纖維的制備方法，為基于AS原纖維誘導(dǎo)的PD模型進(jìn)行的各項(xiàng)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。