曹文軍，李 莉，薛偉鋒*，劉 明

（1.中國檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)遼寧有限公司，遼寧 大連 116600；2.大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116600；3.大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧 大連 116600）

乳粉中的糖類是嬰幼兒的能量來源，通常分為天然糖和添加糖，乳粉中天然糖的添加對(duì)健康有益，而添加過多只會(huì)增加熱量，不能為嬰幼兒提供全面的營養(yǎng)要素，甚至?xí)斐蓩胗變籂I養(yǎng)不良、肥胖、注意力不集中及增加齲齒發(fā)生機(jī)會(huì)等。因此，建立嬰幼兒配方乳粉中糖類含量的檢測方法至關(guān)重要。

乳粉中的糖類主要以單糖、雙糖和低聚糖的形式存在。乳粉中多種糖類的定性及定量檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-2]、酶解法[3]、氣相色譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10-12]和離子色譜法等[13-15]，這些方法均存在前處理操作繁瑣、靈敏度低、分析時(shí)間長、分析目標(biāo)物種類較少等問題。國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)糖類的檢測主要采用高效液相色譜法，在對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，選取不同的色譜柱和流動(dòng)相，受檢測器（示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器）的影響，對(duì)糖類的分析靈敏度相對(duì)較低。針對(duì)復(fù)雜的嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)，高分辨質(zhì)譜在靈敏度和抗干擾能力方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，成為未來乳粉中糖類檢測的重要發(fā)展趨勢[10-12]，結(jié)合優(yōu)化梯度洗脫程序的離子色譜-電化學(xué)檢測法[16-17]在糖類分析中表現(xiàn)出分離效果好、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)[18-19]，已被美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用于食品分析檢測[20]。因此，建立可靠、快速的同時(shí)檢測多種糖類的定性及定量方法極為重要。

本研究試圖建立離子色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中多種糖類的方法，并與國標(biāo)方法中的高效液相色譜法進(jìn)行比較，為嬰幼兒配方乳粉標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)制定、產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供一種新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%） 美國Alfa Aesar公司；醋酸鈉（優(yōu)級(jí)純，純度＞99.9%） 美國Thermo Scientific公司；乙腈溶液（優(yōu)級(jí)純） 德國Merck公司；蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.9%） 日本W(wǎng)ako公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖五糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.9%） 美國Anpel公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000離子色譜儀（配備GS50四元梯度泵、AS-DV自動(dòng)進(jìn)樣器（進(jìn)樣量25 μL））、ED50電化學(xué)檢測器（配有金電極、pH-Ag-AgCl參比電極、四位波形電位和鈦對(duì)電極）、PeakNet 6.8色譜工作站、色譜柱：Thermo Scientific Carbopac PA20陰離子交換柱，包括分析柱（3 mm×150 mm）和保護(hù)柱（3 mm×30 mm）、0.22 μm水相微孔濾膜、OnGuard RP小柱 美國Thermo Scientific公司；H-class高效液相色譜儀（配備蒸發(fā)光檢測器）、Acquity UPLC?BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；超純水系統(tǒng) 德國Sartorius公司；KQ-700DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-J8水浴磁力攪拌器 江蘇省金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；Z-323K離心機(jī) 德國Hermle公司；BSA822電子天平 北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

200 mmol/L氫氧化鈉溶液的配制：準(zhǔn)確量取10.6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%氫氧化鈉溶液，置于流動(dòng)相瓶中，用超純水定容至1 000 mL，瓶內(nèi)充高純氮?dú)?，搖勻上機(jī)備用。

l mol/L醋酸鈉溶液的配制：準(zhǔn)確稱量82.04 g醋酸鈉，置于流動(dòng)相瓶中，用超純水定容至1 000 mL，瓶內(nèi)充高純氮?dú)?，搖勻上機(jī)備用。

蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚半乳糖三糖及低聚半乳糖五糖混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制：分別準(zhǔn)確稱量以上標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g置于100 mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻備用，各物質(zhì)質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L。

所用水均為電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水。

1.3.2 樣品測定

離子色譜法：稱取乳粉樣品0.200 g，置于20 mL容量瓶中，加超純水8 mL，混勻超聲20 min使其溶解，80 ℃水浴20 min，冷卻至室溫后，加乙腈定容，充分搖勻，10 000 r/min離心15 min；取上清液過0.22 μm水相濾膜及OnGuard RP小柱，棄去前8 mL濾液，然后稀釋100 倍上機(jī)測定。

高效液相色譜法：分別按照GB 5009.8—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[21]中6.1節(jié)與GB/T 23528—2009《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 低聚果糖》[22]中6.5.4節(jié)操作。

1.3.3 離子色譜法測定

離子色譜法測定糖類物質(zhì)是通過將其在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離，選用CarboPac PA20陰離子交換柱，包括分析柱（3 mm×150 mm）和保護(hù)柱（3 mm×30 mm），PA型柱填充樹脂是無孔基質(zhì)，主要用于非還原糖化合物的分析。色譜條件為：使用200 mmol/L NaOH與1 mol/L NaAc作為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min，積分安培檢測器檢測。積分工作電位波形設(shè)定如表1所示，梯度洗脫程序如表2所示。

表1 工作電位波形設(shè)定表Table 1 Working electric potential waveform settings

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.4 蔗果五糖溶出量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取1 000 mg/L蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、25、50、100、250 mL，加入2 L容量瓶，用超純水定容，制得溶液質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、125.0 mg/L。以峰面積為縱坐標(biāo)，蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=3.188 7x+4.531 5（R2=0.998 5）

本研究涉及的8 種糖物理性質(zhì)相似，水溶性差異小，因此，選取蔗果五糖代替總糖，測定其溶出量，具體方法如下：稱取乳粉0.200 g，加入12 mL乙腈除蛋白，再用超純水定容至2 L，于40 kHz超聲波條件下提取后10 000 r/min離心15 min；取上清液過0.22 μm水相濾膜及OnGuard RP小柱，進(jìn)入離子色譜儀進(jìn)行分析。根據(jù)蔗果五糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶出量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

離子色譜測定結(jié)果采用Chromeleon軟件、高效液相色譜測定結(jié)果采用Empower軟件分別進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的批處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子色譜法測定結(jié)果

2.1.1 乳粉中糖類的提取條件優(yōu)化

糖類是水溶性物質(zhì)，易溶于水，并且隨著溫度升高糖類在水中溶解度增大，因此采用超純水對(duì)乳粉樣品進(jìn)行提取。為獲得較好的提取效果，先采用超聲提取的方式促進(jìn)乳粉溶解，再采用高溫水浴加速乳粉中的糖類溶解，由于高溫水浴的作用，乳粉中的部分蛋白質(zhì)也被沉淀，在一定程度上降低了干擾。樣品超聲提取時(shí)間以及水浴溫度和時(shí)間通過實(shí)驗(yàn)確定。乳粉樣品經(jīng)過以上處理后仍有殘?jiān)?，可?0 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，以除去不溶物，使乳粉溶液澄清，取上清液過0.22 μm水相微孔濾膜與OnGuard RP小柱，待上機(jī)分析。通過考察超聲提取時(shí)間、水浴溫度和水浴時(shí)間對(duì)蔗果五糖溶出量的影響，獲得最優(yōu)的糖類提取條件。

被分析的8 種糖物理性質(zhì)相似，水溶性差異小，因此以蔗果五糖的溶出量代表其他被測糖類的溶出量。

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)蔗果五糖溶出量的影響Fig. 1 In fluence of sonication time on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

由圖1可知，超聲20 min后，蔗果五糖溶出量不再增加，認(rèn)為乳粉中所含糖類已基本全部溶出。因此，選擇20 min作為乳粉中糖類的超聲提取時(shí)間。

圖2 水浴溫度對(duì)蔗果五糖溶出量的影響Fig. 2 In fluence of water bath temperature on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

圖3 水浴時(shí)間對(duì)蔗果五糖溶出量的影響Fig. 3 In fluence of water bath incubation time on the amount of dissolved 1F-fructofuranosyl nystose

由圖2～3可知，隨著水浴溫度的提高，蔗果五糖溶出量增加。水浴溫度80 ℃以上、水浴時(shí)間20 min之后，蔗果五糖溶出量不再增加，認(rèn)為此時(shí)乳粉中的糖類已全部溶出。因此，選擇水浴溫度80 ℃、水浴時(shí)間20 min。

2.1.2 沉淀劑的選擇

乳粉中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，需在進(jìn)入色譜柱之前除去，一般蛋白沉淀劑選用鹽、酸、乙醇或乙腈。離子色譜柱是離子型交換柱，在乳粉的整個(gè)前處理過程中，要盡可能地減少其他離子帶入，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此不可用鹽來沉淀乳粉蛋白質(zhì)。此外，CarboPac PA20色譜柱（包含分析柱和保護(hù)柱），其基質(zhì)和乳膠粒度、柱容量均較小，因此，用酸作為沉淀劑也不合適，并且強(qiáng)酸對(duì)部分雙糖和低聚糖有分解作用。乙醇對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力不強(qiáng)，因此選用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑，在0～4 ℃條件下沉淀10 min左右即可。

2.1.3 OnGuard RP柱對(duì)乳粉中糖類回收率的影響

OnGuard RP柱是一種反相固相萃取小柱，通常用來除去處理后溶液的大分子，也可除去樣品中的疏水性化合物，主要去除色素、蛋白質(zhì)和脂類，是離子色譜法最常選擇的樣品前處理方式之一。由于糖類極性強(qiáng)，在固相萃取小柱上沒有保留，而色素、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)等相對(duì)于測定組分疏水性較強(qiáng)，容易保留在固相萃取小柱上，經(jīng)過固相萃取小柱后可通過分離除去色素、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，有效降低基質(zhì)干擾。

針對(duì)OnGuard RP小柱是否有利于多種糖類的分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。OnGuard RP小柱使用前依次用8 mL甲醇和8 mL超純水活化后，靜置15 min使用。未使用OnGuard RP小柱條件下，將葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、蔗果三糖、低聚半乳糖五糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)重復(fù)進(jìn)樣3 次，計(jì)算求得峰面積平均值，結(jié)果如表3所示；使用OnGuard RP小柱條件下，將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液過微孔濾膜和OnGuard RP小柱，棄去前8 mL濾液，上機(jī)重復(fù)進(jìn)樣3 次，計(jì)算求得峰面積平均值，結(jié)果如表4所示。比較使用OnGuard RP小柱前后測定結(jié)果的差異。

表3 未使用OnGuard RP小柱時(shí)各目標(biāo)物峰面積Table 3 Peak area of each target compound without use of OnGuard RP column nC×min

由表3～4可知，葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、蔗果三糖、低聚半乳糖五糖、蔗果四糖、蔗果五糖的回收率約為100%，說明OnGuard RP小柱未對(duì)8 種糖產(chǎn)生吸附。因此，使用OnGuard RP小柱進(jìn)行樣品前處理。

表4 使用OnGuard RP小柱時(shí)各目標(biāo)物峰面積和方法回收率Table 4 Peak area and recovery of each target compound with use of OnGuard RP column

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取某一品牌乳粉樣品，按照1.3.2節(jié)的處理方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)樣分析。

表5 8 種糖的含量測定結(jié)果精密度Table 5 Precision for replicate determinations of contents of 8 sugars

表6 保留時(shí)間測定結(jié)果精密度Table 6 Precision for replicate measurements of retention times of 8 sugars

由表5～6可知，8 種糖的含量及保留時(shí)間測定結(jié)果的RSD均小于4.0%，表明方法精密度良好，重復(fù)性好。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測定限

用3 倍信噪比和10 倍信噪比分別計(jì)算8 種糖的檢出限和測定限，標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測定限測定結(jié)果如表7所示。

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測定限Table 7 Standard curves, detection limits and determination limits

2.1.6 加標(biāo)回收率測定結(jié)果

由于乳粉本身乳糖含量太高，不宜用乳粉進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，因此采用豆?jié){進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

表8 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 8 Recoveries of spiked samples

由表8可知，該方法測定豆?jié){樣品中8 種糖類的加標(biāo)回收率為78.0%～96.8%，說明方法準(zhǔn)確度較高、檢測方法可行。

2.1.7 樣品測定結(jié)果

圖4 乳粉A中糖類的離子色譜圖Fig. 4 HPAEC chromatogram of sugars in sample A

圖5 乳粉B中糖類的離子色譜圖Fig. 5 HPAEC chromatogram of sugars in sample B

圖6 乳粉C中糖類的離子色譜圖Fig. 6 HPAEC chromatogram of sugars in sample C

圖7 乳粉D中糖類的離子色譜圖Fig. 7 HPAEC chromatogram of sugars in sample D

對(duì)4 種市售不同品牌（A、B、C、D）的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行測定，離子色譜圖和測定結(jié)果分別如圖4～7和表9所示。

表9 4 種品牌乳粉離子色譜法測定結(jié)果Table 9 Sugar contents of four infant formula samples determined by HPAEC g/100 g

由表9可知，離子色譜法只有蔗糖和蔗果三糖未檢出，其他6 種糖類均有檢出。

2.2 高效液相色譜法測定結(jié)果

GB 5009.8—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[21]規(guī)定了高效液相色譜法檢測食品中葡萄糖、蔗糖、乳糖含量的方法，GB/T 23528—2009《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 低聚果糖》[22]規(guī)定了高效液相色譜法檢測低聚果糖含量的方法，但對(duì)低聚半乳糖的檢測沒有國家標(biāo)準(zhǔn)方法，因此，選用高效液相色譜法檢測嬰幼兒配方乳粉中葡萄糖、蔗糖、乳糖及低聚果糖的含量，并與離子色譜法測定結(jié)果進(jìn)行比較。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液測定

高效液相色譜法測定多種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，各物質(zhì)質(zhì)量濃度低于20 mg/L時(shí)，6 種糖無法完全出峰，質(zhì)量濃度高于500 mg/L時(shí)，乳糖等會(huì)出現(xiàn)平頭峰，不利于檢測。因此，配制的多種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中6 種糖各物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、400 mg/L。質(zhì)量濃度100 mg/L時(shí)的分離圖譜如圖8所示。

圖8 高效液相色譜法分析100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)糖混合液的分離圖譜Fig. 8 HPLC chromatogram of 100 mg/L standard sugar mixture

2.2.2 樣品測定結(jié)果

對(duì)2.1.7節(jié)的4 種市售不同品牌（A、B、C、D）嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行測定，高效液相色譜圖和測定結(jié)果分別如圖9～12和表10所示。

圖9 乳粉A中糖類的高效液相色譜圖Fig. 9 HPLC chromatogram of sugars in sample A

圖10 乳粉B中糖類的高效液相色譜圖Fig. 10 HPLC chromatogram of sugars in sample B

圖11 乳粉C中糖類的高效液相色譜圖Fig. 11 HPLC chromatogram of sugars in sample C

圖12 乳粉D中糖類的高效液相色譜圖Fig. 12 HPLC chromatogram of sugars in sample D

表10 4 種品牌乳粉高效液相色譜法測定結(jié)果Table 10 Sugar contents of four infant formula samples determined by HPLC g/100 g

由表10可知，高效液相色譜法只檢測出4 種品牌乳粉中的乳糖含量，其他5 種糖類均未檢出。

2.3 離子色譜法與國標(biāo)高效液相色譜法測定結(jié)果對(duì)比

由表9～10可知：高效液相色譜法與離子色譜法檢測出乳糖含量基本一致，蔗糖、蔗果三糖2 種方法均未檢出；高效液相色譜法測定糖類含量的靈敏度遠(yuǎn)低于離子色譜法，4 種品牌乳粉中的葡萄糖、蔗果四糖、蔗果五糖用高效液相色譜法均未檢出，而離子色譜法均有檢出；國標(biāo)未規(guī)定高效液相色譜法測定乳粉中低聚半乳糖三糖和低聚半乳糖五糖的方法，并且實(shí)驗(yàn)中也均未檢出，但離子色譜能夠檢測其相應(yīng)含量。

3 結(jié) 論

離子色譜法測定嬰幼兒配方乳粉樣品中多種糖類含量的RSD小于4.0%、加標(biāo)回收率為78.0%～96.8%、檢出限為3～12 mg/100 g，而國標(biāo)高效液相色譜法中葡萄糖、蔗糖、乳糖的檢出限為200 mg/100 g[21]，低聚果糖的檢出限為150 mg/100 g[22]。高效液相色譜法只能檢測出乳粉中的乳糖含量，且與離子色譜法測定結(jié)果基本相同，2 種方法均未檢出蔗糖、蔗果三糖，高效液相色譜法未檢出葡萄糖、蔗果四糖、蔗果五糖，但離子色譜法均能相應(yīng)檢出，說明離子色譜法分析乳粉中糖類含量的靈敏度較高。

離子色譜法測定乳粉樣品的前處理時(shí)間短、成本低、可分析的糖種類多，但是上機(jī)分析時(shí)間為35 min；高效液相色譜可分析的糖種類少、上機(jī)分析時(shí)間為10 min。離子色譜法有望為嬰幼兒配方乳粉標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)制定、產(chǎn)品質(zhì)量控制提供一種新的檢測方法。