徐顯睿，李翠鳳，楊洪來，隋勇軍，李道河，張宗博，陳政言，張?zhí)m威*

（1.青島根源生物技術(shù)集團有限公司食品實驗室，山東 青島 266000；2.青島諾和諾康實業(yè)有限公司，山東 青島 266000；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000）

益生菌是活的微生物，攝入充足數(shù)量益生菌能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生一種或多種已論證功能性的健康益處（聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織）[1]。乳酸桿菌是典型的有益人體腸道健康益生菌，其在腸道中定植、繁殖，進而改善腸道環(huán)境，維持腸道菌群平衡[2]。乳酸桿菌促進腸道健康[3]、提高免疫力[4]、預(yù)防腸胃疾病等有益功能的前提條件是耐受胃腸道的防御機制，即耐受胃中較高的酸度和小腸中較高的膽鹽濃度[5]。此外，乳酸菌需黏附在小腸上皮細胞且保持一定數(shù)量，才能在腸道中停留相對長的時間，從而對宿主細胞發(fā)揮益生功能[6-7]。乳酸菌的表面特性是影響?zhàn)じ侥芰Φ闹匾蛩豙8]。乳酸菌的凝集能力與其黏附宿主細胞的能力具有相關(guān)性，凝集能力越強的乳酸菌在腸道中定植能力越好[9-10]。李洋等[11]從青海酸牦牛乳中分離得到11 株乳酸菌，通過耐酸、耐膽鹽實驗篩選出1 株鼠李糖乳桿菌，該菌在人工胃液和0.3 g/100 mL膽鹽中的存活率分別為119.53%和11.64%。趙彤[12]對1 株開菲爾乳桿菌KL22進行耐酸、耐膽鹽、疏水和自聚能力驗證，并經(jīng)后續(xù)細胞實驗表明該菌株對腸道有較強的黏附能力。向鑫鈴等[13]研究乳酸桿菌的疏水、自聚等表面性質(zhì)與黏附能力的關(guān)系，結(jié)果表明，乳酸桿菌表面性質(zhì)與黏附性有很大關(guān)系，可以通過菌體表面性質(zhì)對具有黏附性的益生菌進行初步快速篩選。

本研究以30 株可用于食品中的乳酸菌為研究對象，通過耐酸、耐膽鹽、疏水作用、靜電作用和自聚能力初步評價各菌株耐酸、耐膽鹽和對細胞的黏附能力，進而篩選出對消化系統(tǒng)耐受性較強的抗性菌株，旨在為研究、開發(fā)潛在功能性益生菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30 株可用于食品中的乳酸菌，分別為菌株Z-40、Z-32、Z-9、Z-6、Z-11、Z-3、Z-13、Z-8、Z-17、Z-7、Z-37、Z-16、Z-34、Z-39、Z-15、Z-33、Z-1、Z-12、Z-35、Z-38、Z-5、Z-41、Z-36、Z-45、Z-46、Z-43、Z-42、Z-44、Z-40、Z-4，均分離自西藏、新疆、青海地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵樣品，由青島根源生物技術(shù)集團有限公司食品菌株資源庫提供；鼠李糖乳桿菌LGG購于丹麥科漢森公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；牛膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；濃鹽酸、NaCl、NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、二甲苯、乙酸乙酯、氯仿、L-半胱氨酸 （均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AG050厭氧培養(yǎng)罐 廣州雷得生物技術(shù)有限公司；SE6001FZH電子天平 美國奧豪斯公司；MEI04E分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；756PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱、BWS-12G電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MX-S旋渦振蕩器 美國賽洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將供試菌株按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中進行活化，經(jīng)2 次傳代，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，收集對數(shù)生長期的菌液。

1.3.2 菌體制備

將活化的供試菌株接種于MRS和MRS+L-半胱氨酸液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000×g離心10 min，收集菌體。用pH 6.8無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，將菌體用4～8 mL pH 6.8無菌PBS重懸，備用。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽能力測定

將活化的供試菌株分別接種于pH 4.0的MRS液體培養(yǎng)基和添加0.5 g/100 mL膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h，以接種鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，用石英比色杯測定各菌株在600 nm波長處的光密度（optical density，OD600nm）[14-17]。

1.3.4 菌株疏水率測定

用pH 6.8無菌PBS將1.3.2節(jié)菌懸液OD600nm調(diào)至0.6，加入1 mL疏水溶劑二甲苯，靜置5 min后充分振蕩120 s，再靜置10 min取水相，以鼠李糖乳桿菌LGG為對照，用石英比色杯測定OD600nm[18]，疏水率按式（1）計算。

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置10 min后水相OD600nm。

1.3.5 菌株靜電作用率測定

以氯仿為路易斯酸，乙酸乙酯為路易斯堿[19]，用pH 6.8無菌PBS將1.3.2節(jié)菌懸液OD600nm調(diào)至0.6，加入1 mL氯仿（或1 mL乙酸乙酯），靜置5 min后充分振蕩120 s，再靜置10 min取水相，以鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，用石英比色杯測定OD600nm，靜電作用率按式（2）計算。

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置10 min后水相OD600nm。

1.3.6 菌株自凝聚率測定

用pH 6.8無菌PBS將1.3.2節(jié)菌懸液OD600nm調(diào)至0.6，于37 ℃分別靜置2、4 h，以鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，測定上層液體OD600nm[20]，自凝聚率按式（3）計算。

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置后菌懸液上層液體OD600nm。

1.3.7 菌株耐人工模擬胃酸和腸液能力測定

選擇在耐酸、耐膽鹽、疏水率、靜電作用率和自凝聚率某一方面或多方面表現(xiàn)優(yōu)秀的菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化傳代3 次獲得菌液；在4 ℃、4 000×g條件下離心10 min收集菌體，用無菌超純水洗滌2 次，等體積重懸于模擬胃液或模擬腸液；在模擬胃液中孵育15、30、60 min，取重懸液10 倍梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h進行活菌計數(shù)；在模擬腸液中孵育5 h，取重懸液10 倍梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h進行活菌計數(shù)。以鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，分別計算各菌株存活率，菌株存活率按式（4）計算。

式中：B0為菌懸液初始菌數(shù)/（CFU/mL）；B1為模擬胃液或模擬腸液處理后菌懸液菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株耐酸、耐膽鹽能力測定結(jié)果

乳酸菌被人體攝入后由口腔進入消化道過程中，胃液中的強酸環(huán)境首先成為大多數(shù)有益乳酸菌進入腸道發(fā)揮益生功效的阻礙。此外，進入到腸道中的乳酸菌對膽鹽的耐受性也是益生菌篩選的重要標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 菌株耐酸和耐膽鹽能力測定結(jié)果Fig. 1 Acid and bile salt tolerance of 31 strains

由圖1可知，菌株Z-3、Z-8、Z-17、Z-16、Z-1、Z-12、Z-15、Z-36、Z-38、Z-39、Z-41、Z-45和Z-46共13 株菌表現(xiàn)出較好的耐酸和耐膽鹽能力，其中菌株Z-3、Z-17、Z-16、Z-1、Z-39和Z-45的耐酸能力明顯高于對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG，OD600nm分別為2.232、2.163、2.189、2.135、2.134和2.237，而菌株Z-12、Z-15、Z-36、Z-38、Z-41、Z-46的耐酸能力接近于鼠李糖乳桿菌LGG，OD600nm為1.772～1.996。

上述對酸耐受性較好的13 株菌株，對膽鹽同樣表現(xiàn)出良好的耐受性。菌株Z-17在質(zhì)量濃度0.5 g/100 mL膽鹽中耐受性最好，OD600nm為1.839，明顯高于鼠李糖乳桿菌LGG（OD600nm＝1.239），表明菌株Z-17的耐膽鹽能力明顯優(yōu)于鼠李糖乳桿菌LGG。其他菌株表現(xiàn)出與鼠李糖乳桿菌LGG近似的膽鹽耐受能力，OD600nm為0.840～1.311。

2.2 供試菌株疏水率測定結(jié)果

圖2 菌株疏水率測定結(jié)果Fig. 2 Hydrophobicity of 31 strains

在益生菌體外篩選實驗中，菌株表面疏水性在一定程度上與菌株在體內(nèi)的定植能力呈正相關(guān)[16,21]。由圖2可知，菌株Z-4、Z-40、Z-32、Z-3、Z-13、Z-7、Z-37、Z-39、Z-15、Z-1、Z-38、Z-36和Z-43共13 株菌具有較強的表面疏水性，其中菌株Z-40、Z-3、Z-7、Z-39、Z-15、Z-1、Z-36和Z-43的疏水率均高于92%，明顯高于其他疏水性良好菌株。菌株Z-40、Z-3和Z-1的疏水性最強，疏水率分別為98.50%、97.57%和97.52%；菌株Z-4、Z-32、Z-13、Z-37、Z-38的疏水率也明顯高于鼠李糖乳桿菌LGG，為68.88%～78.74%。

2.3 供試菌株靜電作用率測定結(jié)果

在腸道中，益生菌以特異性和非特異性2 種方式黏附于小腸黏膜，非特異性方式主要與靜電作用力和疏水作用力有關(guān)[22]。與菌株疏水率類似，菌株的表面電荷量可以反映其在腸道的定植能力[23]。

圖3 菌株靜電作用率測定結(jié)果Fig. 3 Surface charge of 31 strains

由圖3可知，鼠李糖乳桿菌LGG對氯仿和乙酸乙酯的靜電作用率別為85.26%和11.06%，表明該菌株表面攜帶可產(chǎn)生靜電作用的電荷量。菌株Z-40、Z-3、Z-7、Z-16、Z-39、Z-15、Z-1、Z-38、Z-36和Z-43共10 株菌表現(xiàn)出較強的靜電作用力，對氯仿和乙酸乙酯的靜電作用率均高于鼠李糖乳桿菌LGG，其中菌株Z-43和Z-15對氯仿表現(xiàn)出較高的靜電作用率，達100.00%和99.16%，其次為菌株Z-40、Z-39、Z-36、Z-7、Z-1，靜電作用率分別為97.95%、97.76%、97.73%、97.56%和97.35%，其他優(yōu)選菌株對氯仿的靜電作用率為85.14%～91.24%；菌株Z-16對乙酸乙酯的靜電作用率最高，為72.50%，其他優(yōu)選菌株對乙酸乙酯的靜電作用率為20.78%～33.98%，是鼠李糖乳桿菌LGG的2～3 倍。

2.4 供試菌株自凝聚率測定結(jié)果

乳酸菌的高自凝聚作用不僅有利于提高其在腸道中的水平，還有利于菌體在小腸黏膜上定植，共同促使有益菌更好發(fā)揮益生功效[24-25]。

圖4 菌株自凝聚率測定結(jié)果Fig. 4 Auto-aggregation ability of 31 strains

由圖4可知，各供試菌株的自凝聚率與孵育時間基本呈正相關(guān)，孵育時間越長，菌株自凝聚能力越強。菌株Z-6、Z-5、Z-36、Z-46、Z-43、Z-4共6 株菌孵育2、4 h的自凝聚率均高于鼠李糖乳桿菌LGG，其中菌株Z-5和Z-4自凝聚能力最強，菌株Z-5孵育2、4 h的自凝聚率分別為34.46%和33.97%，菌株Z-4孵育2、4 h的自凝聚率分別為30.95%和33.16%。

2.5 優(yōu)選菌株耐模擬胃腸液能力測定結(jié)果

對30 株可用于食品中的乳酸菌進行耐酸、耐膽鹽指標(biāo)初步評價，共篩選出13 株菌，再對30 株供試菌株以疏水率、靜電作用率和自凝聚率3 個指標(biāo)進行菌株黏附性評價，在符合耐酸、耐膽鹽指標(biāo)基礎(chǔ)上，得到Z-7、Z-43和Z-5 3 株新菌株，其中菌株Z-7、Z-43表現(xiàn)出較好的疏水性和靜電作用，菌株Z-5自凝聚率最高。

從供試菌株中篩選具有潛在益生功效的優(yōu)選菌株，其在耐酸、耐膽鹽、疏水率、靜電作用率和自凝聚率指標(biāo)上單方面或多方面優(yōu)于對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG。根據(jù)上述研究結(jié)果，符合要求的菌株為Z-8、Z-40、Z-3、Z-17、Z-12、Z-16、Z-1、Z-15、Z-38、Z-39、Z-36、Z-45、Z-46、Z-43、Z-5和Z-7共16 株，對其進行模擬胃液和模擬腸液耐受性實驗。

圖5 優(yōu)選菌株對模擬胃液的耐受性Fig. 5 Gastric acid tolerance of selected strains

由圖5可知：菌株Z-1、Z-38、Z-36和Z-16在模擬胃液中表現(xiàn)出較優(yōu)的耐受能力，在模擬胃液中孵育60 min活菌數(shù)仍較高，其中菌株Z-1對模擬胃液的耐受性最好，在模擬胃液中孵育60 min的存活率高達93.07%，其次為菌株Z-36，在模擬胃液中孵育60 min的存活率為65.66%，菌株Z-16、Z-38在模擬胃液中孵育60 min的存活率分別為14.44%和22.64%；上述菌株較對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG均表現(xiàn)出更好的模擬胃液耐受能力，而菌株Z-7、Z-43和Z-5模擬胃液耐受能力低于鼠李糖乳桿菌LGG。

圖6 優(yōu)選菌株對模擬腸液的耐受性Fig. 6 Intestinal viability of selected strains

由圖6可知，16 株菌在模擬腸液中均表現(xiàn)出較好的耐受能力，其中菌株Z-3、Z-12、Z-1、Z-45、Z-5在模擬腸液中孵育5 h的存活率超過100%，分別為101.7%、109.16%、106.5%、103.26%和112.83%。

綜上可知，菌株Z-1在模擬胃液和模擬腸液中的耐受能力最強，其在模擬胃液中孵育60 min和模擬腸液中孵育5 h的存活率分別為93.07%和106.5%。

3 結(jié) 論

對30 株可用于食品中的乳酸菌進行耐酸、耐膽鹽指標(biāo)初步評價，共篩選出13 株菌，再對30 株供試菌株以疏水率、靜電作用率和自凝聚率3 個指標(biāo)進行菌株黏附性評價，在符合耐酸、耐膽鹽指標(biāo)基礎(chǔ)上，得到Z-7、Z-43和Z-5 3 株新菌株。其中Z-7、Z-43株菌表現(xiàn)出較好的疏水性和靜電作用，菌株Z-5自凝聚率最高。

對16 株在耐酸、耐膽鹽、疏水率、靜電作用率和自凝聚率指標(biāo)上單方面或多方面優(yōu)于對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG的菌株進行模擬胃液和模擬腸液耐受性實驗，共篩選出Z-1、Z-16、Z-38和Z-39 4 株在模擬胃液中孵育60 min存活率較高的菌株，16 株菌在模擬腸液中的存活率均較高，其中菌株Z-1在模擬胃液中孵育60 min和模擬腸液中孵育5 h的存活率分別為93.07%和106.5%，并且菌株Z-1的疏水率為97.52%，其對氯仿和乙酸乙酯的靜電作用率別為97.35%和24.67%，均表明菌株Z-1具有極強的腸道定植能力。