張飛飛，牟光慶，許運(yùn)鵬，姜 姍，李新玲，趙芙君竺，錢 方,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000；3.賓夕法尼亞州立大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，美國 賓夕法尼亞州 19019）

藏靈菇（Tibetan kefir）屬于開菲爾中的一個(gè)品系，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多種微生物共生聚集而成[1]，其中乳酸菌包括開菲爾乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌和腸膜明串珠菌等，約占60%～70%，酵母菌主要為啤酒酵母、假絲酵母和克魯維酵母等。藏靈菇具有改善腸道菌群、抗感染、降血脂等諸多益生作用[2]。由藏靈菇制備的發(fā)酵乳與傳統(tǒng)酸乳在風(fēng)味、口感和質(zhì)地等品質(zhì)特征方面有明顯差異[3]。

自由基是含有1 個(gè)或多個(gè)未配對電子的物質(zhì)，人體內(nèi)最重要的自由基是超氧陰離子自由基（O2－·）和羥自由基（·OH）等，主要來源于不飽和脂肪酸，且能產(chǎn)生許多其他自由基[4]。在通常情況下，自由基可以在激素調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等生理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但當(dāng)自由基處在較高水平時(shí)，可能會引起各種慢性疾病，包括動脈硬化、癌癥、神經(jīng)性疾病及糖尿病等[5-6]。膽固醇是一種能夠在人體肝臟內(nèi)形成或通過食物攝入的物質(zhì)，對于個(gè)體的生理調(diào)節(jié)必不可少[7]。正常情況下，機(jī)體會將自身合成或由外界攝取的膽固醇轉(zhuǎn)化為甾體激素或作為細(xì)胞膜組成之一，保持血液中膽固醇水平恒定，但若在血清中積累過量的膽固醇，會引發(fā)高血壓、阿爾茨海默癥等多種心腦血管疾病[8-10]。相關(guān)研究表明，人類可以通過食用乳酸菌及其制品攝取抗氧化物質(zhì)[11-12]，并且可以降低血清膽固醇含量，有利于人體健康[13-15]。而藏靈菇中含有大量乳酸菌，這為藏靈菇及其制品具有更好的功能特性提供了依據(jù)。

本研究利用單因素試驗(yàn)對藏靈菇發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得品質(zhì)較好的藏靈菇發(fā)酵乳，進(jìn)一步對產(chǎn)品的抗氧化和降膽固醇功能特性進(jìn)行研究，為藏靈菇發(fā)酵制品的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉 大連新百麗國際工貿(mào)有限公司；全脂牛乳 大連三寰乳業(yè)有限公司；酸乳 市售。

藏靈菇（經(jīng)馴化）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）Z2-2、鼠李糖乳桿菌Z6-1（均分離自藏靈菇）、鼠李糖乳桿菌LGG 大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）6047、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）6038 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

MRS培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 北京陸橋生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸、氯化鐵 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰菲羅啉、Tris-HCl、鄰苯三酚、二乙三胺五乙酸、鐵氰化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇 美國Amresco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋、DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；V-1100D可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；5804R冷凍離心機(jī) 德國Hermle Labortechnlk GmbH公司；AW200SG厭氧工作站 英國Electrotek公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 藏靈菇發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝

操作要點(diǎn)：1）原料乳：12 g/100 mL脫脂復(fù)原乳或全脂牛乳；2）熱處理：95 ℃恒溫水浴5 min；3）發(fā)酵條件：接種量2%～8%，發(fā)酵溫度20～42 ℃，發(fā)酵至凝乳；4）后熟：將發(fā)酵乳放置于4 ℃冰箱后熟12 h；5）成品：脫脂發(fā)酵乳和全脂發(fā)酵乳（全脂發(fā)酵乳只用于測定膽固醇去除率）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以脫脂復(fù)原乳為原料乳，根據(jù)滴定酸度和感官評價(jià)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對發(fā)酵乳的接種量（2%、4%、6%、8%）、發(fā)酵溫度（20、30、37、42 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（7.0、7.5、8.0 h）進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

非脂乳固體含量、蛋白質(zhì)含量和酸度測定均參考GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》[16]中的理化指標(biāo)測定方法。本研究中藏靈菇發(fā)酵乳的初步工藝優(yōu)化使用的原料乳為脫脂復(fù)原乳，故不進(jìn)行脂肪含量測定。

1.3.4 感官評定

參考GB 19302—2010中的評定標(biāo)準(zhǔn)。取20 mL發(fā)酵乳置于50 mL燒杯中，在自然光下觀察組織狀態(tài)，聞其氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味。

表1 藏靈菇發(fā)酵乳感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Tibetan kefir fermented milk

1.3.5 質(zhì)構(gòu)測定

使用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定發(fā)酵乳硬度和黏附性[17]。

1.3.6 微生物數(shù)量測定

乳酸菌數(shù)測定：參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[18]中的平板涂布法。

大腸菌群測定：參考GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[19]中的MPN計(jì)數(shù)法。

1.3.7 膽固醇去除率測定

采用OPA比色法，參考于平等[20]的方法，稍作修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精準(zhǔn)吸取適量1.0 mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（無水乙醇配制），用無水乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與3 mL 95%乙醇和2 mL 50 g/100 mL KOH混合均勻，混合液60 ℃恒溫水浴10 min，冷卻至室溫后加入5 mL正己烷萃取2 min；加入2 mL蒸餾水，充分混勻后靜置分層；取2 mL正己烷（上層），60 ℃吹干有機(jī)相后，加入4 mL 0.5 mg/mL OPA和2 mL濃硫酸，顯色反應(yīng)10 min，測定其550 nm波長處的光密度（optical density，OD550nm）。以膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，OD550nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以4 mL 0.5 mg/mL OPA和2 mL濃硫酸的混合液作為空白對照。

膽固醇去除率測定：將藏靈菇（采用優(yōu)化后條件）、鼠李糖乳桿菌LGG（37 ℃發(fā)酵至凝乳）、鼠李糖乳桿菌Z2-2（37 ℃發(fā)酵至凝乳）、鼠李糖乳桿菌Z6-1（37 ℃發(fā)酵至凝乳）、傳統(tǒng)發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌6038、保加利亞乳桿菌6047接種量1∶1）和市售酸乳（43 ℃發(fā)酵至凝乳）分別按照接種量6%接種到脫脂復(fù)原乳（膽固醇質(zhì)量濃度100 μg/mL，理論值）或全脂牛乳中進(jìn)行發(fā)酵，測定其膽固醇含量，以未發(fā)酵的原料乳作為空白對照。膽固醇去除率按式（1）計(jì)算。

式中：ρ樣為發(fā)酵乳中膽固醇質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ空為原料乳中膽固醇質(zhì)量濃度/（μg/mL）。1.3.8 抗氧化性測定

參考張書文[21]的方法，并稍作修改。發(fā)酵乳8 000 r/min離心10 min進(jìn)行粗提，取發(fā)酵乳乳清分別進(jìn)行DPPH自由基、·OH、O2－·清除率和總還原能力測定。

1.3.8.1 DPPH自由基清除率測定

取1 mL發(fā)酵乳乳清與等體積0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度，以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）為空白對照。DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A1為樣品517 nm波長處的吸光度；A2為空白對照溶液517 nm波長處的吸光度。

1.3.8.2 ·OH清除率測定

向1 mL 2.5 mmol/L鄰-菲羅琳溶液中依次加入1 mL 0.02 mol/L PBS（pH 7.4）和1 mL蒸餾水，混合均勻后，加入1 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 20 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后，37 ℃恒溫水浴1 h，測定混合液在536 nm波長處的吸光度。·OH清除率按式（3）計(jì)算。

式中：Ap為混合液的吸光度；Ab為1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2溶液時(shí)混合液的吸光度；As為1 mL發(fā)酵乳乳清代替1 mL蒸餾水時(shí)混合液的吸光度。

1.3.8.3 O2－·清除率測定

向2 mL 150 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）中加入2 mL 1.2 mmol/L鄰苯三酚和3 mmol/L二乙三胺五乙酸，再加入0.5 mL發(fā)酵乳乳清，25 ℃恒溫水浴10 min，測定混合液在325 nm波長處的吸光度。O2－·清除率按式（4）計(jì)算。

式中：A00為不含發(fā)酵乳乳清和鄰苯三酚混合液的吸光度；A01為不含乳清、含鄰苯三酚混合液的吸光度；A10為含發(fā)酵乳乳清、不含鄰苯三酚混合液的吸光度；A11為含乳清和鄰苯三酚混合液的吸光度。

1.3.8.4 總還原能力測定

向0.5 mL 0.2 mol/L PBS（pH 6.6）中加入0.5 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀和0.5 mL發(fā)酵乳乳清，充分混勻，50 ℃水浴20 min后加入0.5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸沉淀蛋白，4 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液與等體積0.1 g/100 mL FeCl3反應(yīng)10 min，測定其在700 nm波長處的光密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 次平行實(shí)驗(yàn)及2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用SPSS Stastistics 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括Duncan’s檢驗(yàn)和單因素方差分析，認(rèn)為P＜0.05時(shí)存在顯著性差異；使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏靈菇發(fā)酵乳工藝條件優(yōu)化

以脫脂復(fù)原乳為原料乳，根據(jù)發(fā)酵乳酸度和感官評分等指標(biāo)對藏靈菇接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 藏靈菇接種量的確定

表2 42 ℃發(fā)酵條件下藏靈菇接種量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Table 2 Effect of inoculum amount on the quality of Tibetan kefir fermented milk

由表2可知，在相同發(fā)酵溫度（42 ℃）條件下，隨著藏靈菇接種量的提高，發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間隨之縮短，6%和8%接種量的發(fā)酵乳酸度不低于70 °T，符合GB 19302—2010。雖然接種量8%時(shí)發(fā)酵乳凝乳時(shí)間相對較短，但其組織狀態(tài)和感官評分均不及接種量6%的發(fā)酵乳。故將6%作為最佳接種量。

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定

表3 接種量6%條件下發(fā)酵溫度對藏靈菇發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Table 3 Effect of temperature on the quality of the Tibetan kefir fermented milk

由表3可知，藏靈菇接種量為6%時(shí)，30、37、42 ℃條件下發(fā)酵乳的滴定酸度均符合GB 19302—2010，其中37、42 ℃發(fā)酵乳的組織狀態(tài)良好，但42 ℃條件下凝乳時(shí)間較長，這可能是由于藏靈菇中部分菌種嗜熱或耐熱性差，發(fā)酵溫度較高時(shí)其活性被抑制。故將37 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

根據(jù)接種量和發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果，初步確定藏靈菇接種量6%、37 ℃條件下發(fā)酵時(shí)，凝乳時(shí)間約為7.0～8.0 h，因此選擇在此范圍內(nèi)對發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

表4 發(fā)酵溫度37 ℃、接種量6%條件下發(fā)酵時(shí)間對藏靈菇發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Table 4 Effect of fermentation time on the quality of Tibetan kefir fermented milk

由表4可知，不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵乳的組織狀態(tài)差異不大，但發(fā)酵8.0 h的發(fā)酵乳有微量乳清析出，說明發(fā)酵時(shí)間稍長，而發(fā)酵7.0 h的發(fā)酵乳雖然凝乳狀態(tài)良好，但感官評分相對較低，這可能是發(fā)酵時(shí)間相對較短，乳酸菌代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)不足導(dǎo)致的。故將7.5 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

綜上，發(fā)酵溫度37 ℃條件下，藏靈菇接種量6%、發(fā)酵7.5 h制備的藏靈菇發(fā)酵乳無乳清析出，質(zhì)地較好，且酸度符合GB 19302—2010，因此，將上述條件作為最優(yōu)發(fā)酵條件。

成品藏靈菇發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)為1.48×108CFU/mL，大于106CFU/mL，且未檢出大腸菌群，符合發(fā)酵乳標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010。楊希娟[22]、孫卓[23]等研究發(fā)現(xiàn)，藏靈菇及其發(fā)酵乳均對大腸桿菌等致病菌有較好的抑制作用；黃穎等[24]從藏靈菇中篩選出的具有降膽固醇能力菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)也表明，其對大腸桿菌等致病菌有抑制作用。本研究結(jié)果與已有研究相一致。此外，藏靈菇發(fā)酵乳的硬度（178.43 g）大于傳統(tǒng)發(fā)酵乳（133.18 g），說明采用藏靈菇發(fā)酵比傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵制備的產(chǎn)品質(zhì)地優(yōu)；藏靈菇發(fā)酵乳黏附性為－103.52 g·s，非脂乳固體含量（＞8.1%）、蛋白質(zhì)含量（＞2.9%）和滴定酸度（＞70.0 °T）均符合發(fā)酵乳標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 藏靈菇發(fā)酵乳的抗氧化性

機(jī)體氧化代謝產(chǎn)生的自由基對健康有著諸多負(fù)面作用，除自身防御及系統(tǒng)修復(fù)外，從食品中攝取抗氧化物質(zhì)是極其必要的[25]。而乳酸菌及其制品屬于天然抗氧化產(chǎn)品，其抗氧化功效備受關(guān)注[26-28]。

圖1 藏靈菇發(fā)酵乳的抗氧化性Fig. 1 Antioxidant activity of different fermented skim milks

由圖1可知，藏靈菇發(fā)酵乳和傳統(tǒng)發(fā)酵乳（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵）對DPPH自由基的清除率（＞95%）差異不顯著，藏靈菇發(fā)酵乳對O2－·的清除率略高于傳統(tǒng)發(fā)酵乳，但藏靈菇發(fā)酵乳對·OH的清除率（約59%）顯著低于傳統(tǒng)發(fā)酵乳（約94%）（P＜0.05）。此外，2 種發(fā)酵乳均具有還原能力，且OD700nm越大，抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)[29]，藏靈菇發(fā)酵乳的總還原能力顯著低于傳統(tǒng)發(fā)酵乳（P＜0.05）。

根據(jù)上述結(jié)果可知，藏靈菇發(fā)酵乳抗氧化能力中的自由基清除率大小順序?yàn)镈PPH自由基清除率（96.38%）＞·OH清除率（59.25%）＞O2－·清除率（46.08%），藏靈菇發(fā)酵乳對DPPH自由基的清除效果最好。這與米蘭等[30]

研究結(jié)果一致，藏靈菇發(fā)酵乳體外清除DPPH自由基能力較強(qiáng)，清除率高達(dá)87.99%。另外，屈長青等[31]用藏靈菇發(fā)酵乳乳清喂養(yǎng)昆明鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶活力有所上升，進(jìn)一步證實(shí)藏靈菇發(fā)酵乳乳清在動物體內(nèi)的抗氧化活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)發(fā)酵乳相比，藏靈菇發(fā)酵乳的抗氧化性并無顯著差異，這可能與藏靈菇的復(fù)雜菌相有關(guān)。

2.3 藏靈菇發(fā)酵乳的降膽固醇能力

圖2 不同脫脂發(fā)酵乳的膽固醇去除率Fig. 2 Cholesterol removal rates of different fermented skim milks

已有關(guān)于藏靈菇中具有高效降膽固醇能力菌株的篩選、分離等報(bào)道[24,32-33]。由圖2可知，前期分離自藏靈菇的2 株鼠李糖乳桿菌（鼠李糖乳桿菌Z2-2和鼠李糖乳桿菌Z6-1）雖然具有一定的降膽固醇能力，但藏靈菇發(fā)酵乳膽固醇去除率最高（37.98%），約為傳統(tǒng)發(fā)酵乳的2 倍，且顯著高于市售酸乳（P＜0.05），說明藏靈菇具有更高的降膽固醇能力，可能是由于藏靈菇中含有更多可利用膽固醇的乳酸菌等菌株。

為進(jìn)一步探究藏靈菇的降膽固醇能力，用藏靈菇制成全脂發(fā)酵乳，比較其與傳統(tǒng)發(fā)酵乳和益生性較好的鼠李糖乳桿菌LGG發(fā)酵乳的膽固醇去除率。

圖3 不同全脂發(fā)酵乳的膽固醇去除率Fig. 3 Cholesterol removal rates of different fermented whole milks

由圖3可知，藏靈菇全脂發(fā)酵乳的膽固醇去除率（40.68%）略高于傳統(tǒng)全脂發(fā)酵乳（36.29%），顯著高于鼠李糖乳桿菌LGG全脂發(fā)酵乳（24.23%）（P＜0.05），進(jìn)一步說明藏靈菇降膽固醇能力較強(qiáng)。

3 結(jié) 論

通過滴定酸度和感官評價(jià)等指標(biāo)，對藏靈菇發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其品質(zhì)最優(yōu)時(shí)的生產(chǎn)工藝為接種量6%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間7.50 h。此條件下的藏靈菇發(fā)酵乳酸度適宜、口感細(xì)膩、質(zhì)地均勻，具有獨(dú)特風(fēng)味，乳酸菌含量較高，不含大腸菌群，且各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合發(fā)酵乳標(biāo)準(zhǔn)。且藏靈菇發(fā)酵乳具有抗氧化活性和較高的降膽固醇能力。近些年來，藏靈菇相關(guān)研究成為熱點(diǎn)，包括藏靈菇生理活性、菌相組成及優(yōu)勢菌種的分離等[2,34-35]，本研究對藏靈菇發(fā)酵制品的工藝條件和功能特性進(jìn)行初步研究，為開發(fā)抗氧化或降膽固醇制品提供參考依據(jù)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)探究藏靈菇中菌株間的生物活性是否具有協(xié)同效應(yīng)，且需要設(shè)計(jì)相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將藏靈菇的益生性最大化。