張燁 張璐 劉修恒

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙?；敢种苿〤UDC-101對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）雄激素受體剪切變異體7（AR-V7）表達(dá)的影響，為臨床提供相應(yīng)的理論參考。 方法 2018年1月～2019年6月通過免疫印跡法對(duì)CRPC的PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等17株細(xì)胞株中的AR-V7蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，篩選AR-V7表達(dá)最高細(xì)胞株進(jìn)一步研究。并按照不同抑制劑分為MG149組和CUDC-101組，比較兩種抑制劑對(duì)CRPC細(xì)胞中AR-V7表達(dá)降低情況。再按照不同制劑方法分為單獨(dú)使用MDV3100組、30 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組、300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組，分析對(duì)CRPC細(xì)胞中AR-V7表達(dá)的影響。 結(jié)果 CRPC細(xì)胞株22Rvl存在AR-V7陽性表達(dá)，PC-3、VCaP和LNCap等CRPC細(xì)胞株，均未發(fā)現(xiàn)AR-V7陽性表達(dá)。CUDC-101組AR-V7表達(dá)陽性率低于MG149組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。30、300 nmol 劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組AR-V7陽性表達(dá)率均低于單獨(dú)使用MDV3100組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 組蛋白去乙?；敢种苿〤UDC-101應(yīng)用在CRPC患者中，可以降低AR-V7表達(dá)水平，提高內(nèi)分泌治療敏感性，具有治療CRPC的潛力。

[關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑;CUDC-101;前列腺癌;雄激素受體剪切變異體7

[中圖分類號(hào)] R733.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（a）-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of histone deacetylase inhibitor CUDC-101 on the expression of androgen receptor shear variant 7 （AR-V7） in castration-resistant prostate cancer （CRPC）， and to provide relevant theoretical reference for clinical practice. Methods From January 2018 to June 2019， the expression of AR-V7 protein in CRPC PC-3， VCaP， 22Rvl， LNCap and other 17 cell lines were detected by immunoblotting， while the highest AR-V7 expression was screened further the study. According to different inhibitors， the cell lines were divided into MG149 group and CUDC-101 group. The two inhibitors were compared to reduce the expression of AR-V7 in CRPC cells. Then according to different preparation methods， the cell lines were divided into using MDV3100 alone group， 30 nmol dose CUDC-101 combined application group， and 300 nmol dose CUDC-101 combined application group. The effects on the expression of AR-V7 in CRPC cells were analyzed. Results CRPC cell line 22Rvl had AR-V7 positive expression， and PC-3， VCaP and LNCap CRPC cell lines did not find AR-V7 positive expression. The positive rate of AR-V7 expression in the CUDC-101 group was lower than that in the MG149 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The AR-V7 positive expression rate 30， 300 nmol dose CUDC-101 combined application group were lower than that in the MDV3100 group alone， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Histone deacetylase inhibitor CUDC-101 can reduce the expression level of AR-V7， while improve the sensitivity of endocrine therapy. It has the potential to treat CRPC.

[Key words] Histone deacetylase inhibitors; CUDC-101; Prostate cancer; Androgen receptor splice variants 7

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，好發(fā)于中老年群體，尤其是70歲以上老年群體發(fā)病率保持在較高水平，是男性泌尿系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，全世界每年因前列腺癌死亡的男性患者數(shù)量超過25萬，并仍然呈上升趨勢(shì)。前列腺癌發(fā)病原因比較復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為前列腺癌發(fā)生與發(fā)展依賴于雄激素（AR）信號(hào)傳導(dǎo)以及雄激素本身，即AR信號(hào)持續(xù)傳導(dǎo)在支持腫瘤細(xì)胞存活方面發(fā)揮著積極作用[3]。針對(duì)目前臨床對(duì)前列腺癌的治療，對(duì)于AR信號(hào)通路的過度激活普遍采用雄激素剝奪治療。盡管最初有一定效果，但是絕大部分患者在一段時(shí)間的治療后會(huì)產(chǎn)生不同程度的抵抗，逐步進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）[4]。CRPC的發(fā)生意味著前列腺癌發(fā)展到嚴(yán)重程度，病情十分危急，是臨床上棘手的難題[5]。雄激素受體剪切變異體7（AR-V7）是AR的重要變異體，由于特殊的結(jié)構(gòu)受到越來越多的關(guān)注。同時(shí)，研究顯示其與CRPC的發(fā)生發(fā)展以及耐藥性的形成存在密切的關(guān)系，與患者的預(yù)后存在密切聯(lián)系[6]。近年來，隨著CRPC的研究不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)于CRPC患者AR表達(dá)具有一定的抑制作用，但目前并無太多報(bào)道。本研究通過分析組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101的應(yīng)用對(duì)于CRPC患者AR-V7表達(dá)的影響，探究其對(duì)于CRPC治療并取得了理想效果?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組蛋白去乙?；敢种苿┲蠧UDC-101和MG149抑制劑（上海賽導(dǎo)通生物科技公司，871026-44-7）;MDV3100（北京樂博生物科技公司，915087-33-1）。中科院研究所提供PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等前列腺癌細(xì)胞株?？谷薃R-V7特異性小鼠抗體（GR2195 17-16）及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠抗體（1387300604）分別購自Abcam公司及上海碧云天生物科技公司，細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（080719190830）購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.2 方法

前列腺細(xì)胞的培育和給藥檢測(cè)，嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行操作。采用免疫印跡法對(duì)AR-V7表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)：在完成前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)之后，對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，并對(duì)其濃度予以測(cè)定，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜處理。轉(zhuǎn)膜完成后，使用濃度為5%脫脂奶粉溶液將其封閉，1 h后加入抗人AR-V7特異性小鼠抗體。第2天清晨洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，1 h后洗滌4次加人ECL試劑，使用化學(xué)發(fā)光法獲取目標(biāo)條帶，使用bandscan（version 5.0）凝膠圖像分析軟件測(cè)定灰度值，進(jìn)而比較AR-V7表達(dá)的差異。

采用免疫印跡法對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、VCaP、22Rvl、LNCapAR-V7陽性的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)：分別向不同的前列腺癌細(xì)胞株中加入濃度20 μmol的MDV3100，而后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步檢測(cè)蛋白去乙?；敢种苿┲蠧UDC-101和MG149抑制劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞株陽性表達(dá)的影響：AR-V7陽性的細(xì)胞株中，分別加入CUDC-101和MG149抑制劑，2 d后收集不同的細(xì)胞株，使用免疫印跡法檢測(cè)AR-V7的表達(dá)。進(jìn)一步比較CUDC-101聯(lián)合MDV3100對(duì)前列腺癌細(xì)胞株AR-V7陽性表達(dá)的影響：AR-V7陽性的細(xì)胞株中，分別加入30 nmol、300 nmol的CUDC-101以及30 μmol的MDV3100，2 d后收集不同的細(xì)胞株，使用免疫印跡法檢測(cè)AR-V7的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果分析

CRPC患者細(xì)胞株P(guān)C-3、VCaP和LNCap，均不存在AR-V7陽性表達(dá)情況（AR-V7陽性表達(dá)率為0.00%）。CRPC患者細(xì)胞株22Rvl，存在AR-V7陽性表達(dá)，AR-V7陽性表達(dá)率為75.60%。細(xì)胞株22Rvl處理后AR-V7陽性表達(dá)率高于其他細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 CUDC-101和MG149處理細(xì)胞株22Rvl后AR-V7陽性表達(dá)率比較

蛋白去乙酰化酶抑制劑中CUDC-101和MG149分別處理CRPC細(xì)胞株22Rvl后，CUDC-101組AR-V7陽性表達(dá)率低于MG149組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 不同抑制方法對(duì)前列腺癌細(xì)胞株的抑制作用比較

30 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組及300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組對(duì)AR-V7陽性表達(dá)的抑制率均高于單獨(dú)使用MDV3100組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 4.250、5.765，P < 0.05）。30 nmol劑量CUDC-10聯(lián)合MDV3100組與300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

我國前列腺癌患者很大一部分在初診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)效果不理想或已失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，內(nèi)分泌治療是主要治療方法，因此CRPC患者比例在增加[8]。在前列腺癌患者中，普遍存在前列腺特異性抗原升高的現(xiàn)象，并且以CRPC患者表現(xiàn)得尤為明顯，而又受到AR通路調(diào)節(jié)，升高幅度因此受影響[9]。臨床實(shí)踐調(diào)查顯示，采用內(nèi)分泌治療后，幾乎所有患者在取得最初良好收益后，病情會(huì)逐步發(fā)展為CRPC[10]。而AR通路過度激活，被領(lǐng)域內(nèi)研究學(xué)者認(rèn)為是進(jìn)展的主要原因[3，11]。MDV3100和阿比特龍，可以通過結(jié)合AR，阻斷受體與雄激素結(jié)合，從而降低AR的陽性表達(dá)，對(duì)抗腫瘤的生長(zhǎng)[12]。該方法能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存期，一般在5個(gè)月作用，但是在遠(yuǎn)期產(chǎn)生耐藥性的可能性非常大，疾病的惡化同樣會(huì)出現(xiàn)[13]。

AR信號(hào)通路的作用，從前列腺癌的發(fā)病、發(fā)展到惡化，直至患者死亡，始終存在并出現(xiàn)。作用機(jī)制表現(xiàn)為：雄激素結(jié)合AR后，構(gòu)象發(fā)生變化而被激活，可進(jìn)一步激活一系列下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，進(jìn)而影響疾病的變化發(fā)展[14]。AR通路傳導(dǎo)在支持前列腺細(xì)胞存活方面發(fā)揮積極作用，通過以下3種方式上調(diào)：增加雄激素生物合成、AR擴(kuò)增及過表達(dá)、AR突變。AR-V7是AR突變的重要表現(xiàn)形式，也是AR信號(hào)通路的重要介質(zhì)之一，AR-V7的持續(xù)激活被認(rèn)為是AR通路過渡激活的主要因素之一[15]。相關(guān)研究顯示[16]，MDV3100和阿比特龍無法阻斷AR-V7的激活，而這也導(dǎo)致了AR-V7能夠在雄激素水平較低的情況下對(duì)任意前列腺癌細(xì)胞遺傳物質(zhì)的控制，誘發(fā)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，AR-V7陽性的細(xì)胞株22Rvl對(duì)MDV3100具有很強(qiáng)的耐藥性，進(jìn)一步提示AR-V7在前列腺癌細(xì)胞對(duì)MDV3100耐藥性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮積極作用。

現(xiàn)已證明在雄激素存在的條件下，AR-V7具有AR的活性;而在沒有雄激素配體的情況下，AR-V7在大量共調(diào)節(jié)因子的幫助下完成最終的激活并調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)AR的轉(zhuǎn)錄活性，與CRPC密切相關(guān)[17]。因此，有學(xué)者認(rèn)為[18-19]，可以將AR-V7的表達(dá)水平的高低作為預(yù)測(cè)CRPC患者預(yù)后的重要指標(biāo)，AR-V7過度表達(dá)則往往意味著CRPC復(fù)發(fā)率和死亡率的上升。若降低CRPC患者的AR-V7表達(dá)水平能夠改善患者抗雄治療效果，間接提示AR-V7可以其促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生[20-21]。相關(guān)研究顯示[22]，前列腺癌中的AR-V7表達(dá)與表觀修飾可能存在一定的聯(lián)系。表觀遺傳抑制劑包括許多類型，本實(shí)驗(yàn)CUDC-101便是其中一種。表觀遺傳抑制劑與內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)合應(yīng)用在前列腺癌領(lǐng)域顯現(xiàn)出巨大的潛力[23-24]。本研究結(jié)果顯示，使用CUDC-101處理CRPC細(xì)胞株22Rvl后，AR-V7陽性表達(dá)率低于蛋白去乙酰化酶抑制劑中MG149（P < 0.05），提示CUDC-101對(duì)CRPC細(xì)胞株22Rvl中AR-V7陽性表達(dá)的抑制效果更好。在不同抑制方法方面，30、300 nmol的CUDC-101聯(lián)合MDV3100使用AR-V7陽性表達(dá)率低于MDV3100單獨(dú)使用（P < 0.05），這主要是因?yàn)槁?lián)合使用降低了CRPC耐藥性，對(duì)AR-V7陽性表達(dá)的抑制作用更明顯，同樣為CRPC新藥的研究探索新方向。但是本研究也存在一定的不足，不同藥物濃度對(duì)AR-V7陽性表達(dá)的抑制效果并無進(jìn)一步分析，需要在今后研究中加以改進(jìn)。

綜上所述，在CRPC患者中采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑CUDC-101可以降低AR-V7表達(dá)水平，可作為治療CRPC潛在治療藥物。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Zhou CK，Check DP，Lortet-Tieulent J，et al. Prostate cancer incidence in 43 populations worldwide： An analysis of time trends overall and by age group [J]. Int J Cancer，2016，138（6）：1388-1400.

[2]? 許洪修，白進(jìn)良.AR-V7在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中的作用[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2016，21（8）：649-652.

[3]? Martinez-Breijo S，Chantada-Abal V，Aller-Rodriguez M，et al. Castration resistance mechanisms in prostate cancer [J]. Arch Esp Urol，2018，71（8）：628-638.

[4]? Al-Salama ZT. Apalutamide：A Review in Non-Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer [J]. Drugs，2019，79（14）：1591-1598.

[5]? Herrmann K，Bluemel C，Weineisen M，et al. Biodistribution and radiation dosimetry for a probe targeting prostate-specific membrane antigen for imaging and therapy [J]. J Nucl Med，2015，56（6）：855-861.

[6]? Takayama KI. Splicing Factors Have an Essential Role in Prostate Cancer Progression and Androgen Receptor Signaling [J]. Biomolecules，2019，9（4）：13101-13113.

[7]? 徐春梅，張子亦，陳羲，等.組蛋白去乙酰化酶抑制劑抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（4）：509-513.

[8]? Sir Alpajaro，Harris J，Evans CP. Non-metastatic castration resistant prostate cancer：a review of current and emerging medical therapies [J]. Prostate Cancer Prostatic Dis，2019，22（1）：16-23.

[9]? 曾浩，種鐵，賀大林，等.去勢(shì)抵抗性前列腺癌最新指南解讀——暨中國西部專家共識(shí)[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2017，22（2）：85-94.

[10]? Chandrasekar T，Yang JC，Gao AC，et al. Mechanisms of resistance in castration-resistant prostate cancer （CRPC）[J]. Transl Androl Urol，2015，4（3）：365-380.

[11]? Pu F，Salarian M，Xue S，et al. Prostate-specific membrane antigen targeted protein contrast agents for molecular imaging of prostate cancer by MRI [J]. Nanoscale，2016，8（25）：12668-12682.

[12]? Belderbos B，Sieuwerts AM，Hoop EO，et al. Associations between AR-V7 status in circulating tumour cells，circulating tumour cell count and survival in men with metastatic castration-resistant prostate cancer [J]. Eur J Cancer，2019，121（9）：48-54.

[13]? 林國偉，謝錦來，李勵(lì)獻(xiàn)，等.AR-V7對(duì)前列腺癌激素抵抗敏感時(shí)間的預(yù)測(cè)作用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2015，43（7）：858-862.

[14]? Karantanos T，Evans CP，Tombal B，et al. Understanding the mechanisms of androgen deprivation resistance in prostate cancer at the molecular level [J]. Eur Urol，2015，67（3）：470-479.

[15]? 熊詩詩，吳介恒，韓東暉，等.針對(duì)前列腺特異性膜抗原的抗體靶向治療研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2017，33（2）：278-282.

[16]? Markowski MC，F(xiàn)rick KD，Eshleman JR，et al. Cost-Savings Analysis of AR-V7 Testing in Patients With Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer Eligible for Treatment With Abiraterone or Enzalutamide [J]. Prostate，2016，76（16）：1484-1490.

[17]? 韓雪迪，李囡，林新峰，等.前列腺特異性膜抗原靶向分子探針在前列腺癌診斷及治療中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2016，24（10）：790-792.

[18]? Bastos DA，Antonarakis ES. CTC-derived AR-V7 detection as a prognostic and predictive biomarker in advanced prostate cancer [J]. Expert Rev Mol Diagn，2018， 18（2）：155-163.

[19]? 孔祥輝，黃曉軍，呂伯東.AR-v7作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌治療體液標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].中國男科學(xué)雜志，2018，32（4）：69-72.

[20]? Bryce AH，Antonarakis ES. Androgen receptor splice variant 7 in castration-resistant prostate cancer：Clinical considerations [J]. Int J Urol，2016，23（8）：646-653.

[21]? 陳澤昱，董強(qiáng)，柳良仁，等.轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌臨床治療標(biāo)志物——雄激素受體剪接變異體7[J].中華男科學(xué)雜志，2019，25（2）：172-176.

[22]? Mahajan K，Malla P，Lawrence HR，et al. ACK1/TNK2 Regulates Histone H4 Tyr88-phosphorylation and AR Gene Expression in Castration-Resistant Prostate Cancer [J]. Cancer Cell，2017，31（6）：790-803.

[23]? 林晨，劉湘鄂，吳天玉，等.康艾注射液輔助化療聯(lián)合內(nèi)分泌治療中晚期前列腺癌效果分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2019，17（28）：7-9.

[24]? 張碧嚴(yán)，李玉鳳，賴蕓，等.中藥復(fù)方PC-SPESⅡ抑制人前列腺癌細(xì)胞LNCaP增殖及其對(duì)AR，PSA表達(dá)的影響[J].中國中藥雜志，2015，40（5）：950-956.

（收稿日期：2019-09-10? 本文編輯：王曉曄）