李治建 阿米娜·阿不拉 馬麗

[摘要] 目的 探討鞣花酸對紅色毛癬菌細胞活力及金屬蛋白酶（MEP）、枯草菌素蛋白酶（SUB）基因表達的影響。方法 實驗分5組，分別為生長對照組，特比奈酚0.08 μg/mL組，鞣花酸64、128、256 μg/mL三個劑量組。藥物作用紅色毛癬菌7 d后，采用CCK-8測定紅色毛癬菌細胞活力，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方法檢測紅色毛癬菌蛋白酶MEP、SUB基因表達量。 結(jié)果 與生長對照組比較，特比奈酚0.08 μg/mL和鞣花酸64、128、256 μg/mL劑量組能明顯抑制紅色毛癬菌細胞活力，并能使真菌中蛋白酶MEP、SUB基因表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 鞣花酸對紅色毛癬菌有較強的抑制作用，可通過抑制真菌中蛋白酶MEP、SUB基因表達來發(fā)揮其抗真菌作用。

[關(guān)鍵詞] 鞣花酸;紅色毛癬菌;金屬蛋白酶;枯草菌素蛋白酶

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（a）-0015-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of ellagic acid on the cell activity and expression of metalloproteinase （MEP） and subtilis proteinase （SUB） genes in trichophyton rubrum. Methods The experiment was divided into 5 groups， including the growth control group， the terbinanol 0.08 μg/mL group， and the ellagic acid 64， 128 g/mL and 256 g/mL dose groups. After 7 days of drug action， CCK-8 was used to determine the cell activity of trichophyton rubrum， and reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the gene expression levels of trichophyton rubrum protease MEP and SUB gene. Results Compared with the growth control group， the tepinecol 0.08 g/mL and the ellagic acid 64， 128 μg/mL and 256 μg/mL dose groups significantly inhibited the cell activity of trichophyton rubrum， and decreased the expression levels of protease MEP and SUB genes in the fungi， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Ellagic acid has a strong inhibitory effect on trichophyton rubrum， and can exert its antifungal effect by inhibiting the expression of protease MEP and SUB genes in fungi.

[Key words] Ellagic acid; Trichophyton rubrum; Metalloproteinase; Subtilis proteinase

鞣花酸（ellagic acid，EA）是存在于許多蔬菜、水果和藥材中的天然多酚組分，如黑莓、覆盆子、葡萄和核桃等。作為沒食子酸的二聚體形式，它由具有4個羥基和2個代表親水部分的內(nèi)酯環(huán)的稠合四環(huán)結(jié)構(gòu)組成，已發(fā)現(xiàn)EA具有多種藥理特性，例如：抗癌、抗氧化、抗纖維化、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理作用[1-2]。本課題組從地錦草（Euphorbia humifusa Willd）中分離得到了鞣花酸，其具有抗皮膚真菌的作用[3-4]，鞣花酸對紅色毛癬菌（trichophyton rubrum）最敏感，對紅色毛癬菌感染致皮膚癬菌病豚鼠具有一定的治療作用，且能明顯抑制紅色毛癬菌細胞膜中甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）酶活性、使羊毛甾醇蓄積，且有明顯的劑量依賴性[5]。紅色毛癬菌是最常見的引起皮膚癬菌的感染性真菌，典型特征是通過釋放多種蛋白水解酶侵嗜皮膚角蛋白，并可侵入角質(zhì)化的結(jié)構(gòu)，例如皮膚角質(zhì)層、頭發(fā)和指甲，通過分解受侵組織來滿足自身新陳代謝需要，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶（MEP）和枯草菌素蛋白酶（SUB）在組織入侵及控制宿主的防御機制上也起著十分重要的作用[6-8]。本研究圍繞鞣花酸對紅色毛癬菌細胞活力及MEP、SUB基因表達的影響，進一步探討鞣花酸抗紅色毛癬菌的作用特點。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

鞣花酸，南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ13041101;鹽酸特比萘芬（TBF），Sigma公司，批號：78628805;馬鈴薯培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA），北京奧博生物科技有限公司，批號：20150608;RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Gibco，批號：31800022;3-（N-嗎啡林）丙磺酸（MOPS），美國Amresco，批號：0670;二甲基亞砜（DMSO），SCIENTIFIC RESEARCH，批號：201501 02;其他試劑均為分析純。

1.2 菌株

紅色毛癬菌（trichophyton rubrum，ATCC 28188），凍存于-20℃冰箱，使用時通過NCCLS M38-A方法制備絲狀真菌接種懸液[10]，凍存的真菌挑取生長良好的直徑約為3 mm的孢子和菌絲片段的混合物，接種到SDA培養(yǎng)基的斜面中央位置，在28℃下生長第7～14天后進行藥敏實驗。

1.3 儀器

BHC-1300ⅡA型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;FM型生化培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;DM2500顯微鏡，德國Leica;K5500型核酸蛋白定量儀，北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.4 方法

1.4.1 鞣花酸對紅色毛癬菌細胞活力的影響? 實驗分五組，分別為生長對照組（在96孔板相應(yīng)位置加菌接種液100 μL和RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL），特比奈酚0.08 μg/mL組（在96孔板相應(yīng)位置加菌接種液100 μL和濃度為0.16 μg/mL RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL），鞣花酸64、128、256 μg/mL三個劑量組（在96孔板相應(yīng)位置分別加菌接種液100 μL和濃度為128、256、512 μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL）。各組處理情況：將紅色毛癬菌接種于SDA的斜面上，置于28℃孵育箱培養(yǎng)7～14 d。采用移液器的吸頭尖端輕輕地挑撥菌落，將菌落懸浮在約無菌0.85%鹽水中，將所得的分生孢子、孢子囊和菌絲片段的混合物轉(zhuǎn)移至無菌管中。使較重的顆粒沉降3～5 min，收集上部均勻懸浮液，并用渦旋混合器混合15 s。采用血細胞計數(shù)板將分生孢子、孢子囊和菌絲片段的懸浮液的濃度調(diào)節(jié)在0.4×106～5×106 cfu/mL，用RPMI-1640培養(yǎng)基將其稀釋50倍至2倍終濃度[9]。將調(diào)好的分生孢子、孢子囊和菌絲片段的懸浮接種液分別吸取100 μL加入相對應(yīng)的微孔之內(nèi)，使每1個濃度梯度的抗真菌藥物及其2倍終濃度的分生孢子、孢子囊和菌絲片段的懸浮接種液分別按1∶1的比例稀釋到終濃度，鞣花酸的終濃度從高向低的順序依次為：256、128、64 μg/mL;TBF的試驗終濃度由高向低依次為：0.08 μg/mL;生長對照組不加藥物，僅加RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL。28℃孵育7 d后嚴格按照CCK-8試劑盒的操作說明來處理樣品，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，按照試劑盒說明書在酶標儀上450 nm測定吸光度。

1.4.2 鞣花酸對紅色毛癬菌MEP、SUB基因表達的影響? 實驗分5組，分別為紅色毛癬菌的生長對照組，特比奈酚0.08 μg/mL組，鞣花酸64、128、256 μg/mL三個劑量組。藥物干預(yù)方法同上，28℃孵育7 d后先進行5000 r/min（離心半徑8 cm，下同）、10 min離心菌液，用研缽研磨液氮處理的組織樣品，置于加有1 mL Trizol的離心管中，靜置5～10 min;加入0.2 mL氯仿上下劇烈混勻15～30 s，然后靜置3 min（冰?。?4℃，12 000 r/min離心15 min;取水相到新的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻，冰浴10 min;4℃，12 000 r/min離心10 min;傾倒上層液體，用75%冰乙醇沉淀（1 mL），混勻;4℃，12 000 r/min離心5 min;干燥。加入DEPC處理水溶解RNA，測濃度，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用TAKARA公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶按40 μL體系進行反轉(zhuǎn)錄。目的基因引物由烏魯木齊歐意生物有限公司合成，具體序列見表1。反應(yīng)體系20 μL：包括dd H2O 8.2 μL、2×Master Mix 10 μL、上下游引物0.8 μL及cDNA 1 μL，基因的PCR擴增條件：50℃預(yù)變性2 min、95℃聚合酶激活2 min、95℃變性15 s、60℃退火1 min，40個循環(huán)，72℃延伸7 min。熒光定量PCR反應(yīng)體系反應(yīng)后用1%凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物大小顯示與理論值一致，對擴增產(chǎn)物進行光密度分析，與β-actin值相比并計算相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單向方差分析（ANOVA），首先比較各組的總體平均值，統(tǒng)計檢驗水準為0.05，后進行給藥組和生長對照組的多對一比較。根據(jù)方差齊性檢驗的結(jié)果，方差齊采用LSD方法進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，而方差不齊采用Tamhane′s的T2方法進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸對紅色毛癬菌細胞活力的影響

與生長對照組比較，特比奈酚0.08 μg/mL組和鞣花酸64、128、256 μg/mL劑量組作用于紅色毛癬菌后，OD值明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.2鞣花酸對紅色毛癬菌MEP、SUB基因表達的影響

與生長對照組比較，特比奈酚0.08 μg/mL組和鞣花酸64、128、256 μg/mL劑量組作用于紅色毛癬菌后，MEP、SUB基因表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3 討論

近年來，皮膚癬菌病作為皮膚科臨床上最常見的淺表真菌感染，由于其流行病學(xué)的改變和耐藥性不斷增加而備受關(guān)注。目前，糖尿病患者、老年人和免疫功能低下人群的皮膚癬菌病病例數(shù)量有所增加。紅色毛癬菌是最常見的皮膚癬菌病致病真菌。盡管在實踐中有許多有效的抗真菌藥物，皮膚癬菌病的流行率仍然沒有改變，慢性和復(fù)發(fā)性真菌感染的發(fā)病率上升。有關(guān)抗皮膚癬菌藥物的體外抗真菌藥敏試驗、體內(nèi)相關(guān)性及抗真菌耐藥機制亟待研究[10]。CCK-8是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑，WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的結(jié)晶甲瓚Formazan，細胞增殖越多越快，則顏色越深;細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系，利用這一特性直接用酶標儀檢測Formazan含量的OD值，可以直接檢測細胞活力的強弱。鞣花酸64、128、256 μg/mL劑量組作用于紅色毛癬菌后對OD值具有明顯降低作用，提示鞣花酸作用紅色毛癬菌后，真菌細胞出現(xiàn)死亡，生成橙黃色的結(jié)晶甲瓚Formazan的量減少，從而導(dǎo)致OD值降低。以往的研究表明，鞣花酸體內(nèi)外均具有一定的抗真菌作用，且對紅色毛癬菌細胞膜生物合成途徑有一定抑制作用，皮膚癬菌在入侵宿主組織的過程中通過釋放多種蛋白水解酶分解受侵組織來滿足自身新陳代謝需要，外分泌蛋白酶被認為是毛癬菌最為重要的毒力因子[6-7]，并且這些蛋白水解酶在組織入侵及控制宿主的防御機制上也起著十分重要的作用[11-12]。蛋白水解酶是皮膚癬菌潛在致病毒力因子，SUB蛋白酶在真菌侵襲角化組織中起重要作用，不同病例的紅色毛癬菌SUB的表達水平與臨床癥狀的嚴重程度密切相關(guān);紅色毛癬菌致病力的大小可能與SUB的不同表達有關(guān)，已有7個編碼SUB基因在毛癬菌中分離得到，其中SUB1、SUB3-7是皮膚癬菌特異性的致病毒力因子調(diào)控基因[13]。

具有角蛋白水解活性的角蛋白酶被認為是包括紅色毛癬菌在內(nèi)的淺部致病性真菌毒力因子中最為重要的一種[14-16]。M36家族的金屬蛋白酶（Mep）是皮膚癬菌入侵宿主的重要毒力因子，在真菌感染過程中可能與其獲得營養(yǎng)和擴大侵襲范圍有關(guān)，在以前的研究中，從煙曲霉和米曲霉的MEP基因序列設(shè)計的引物被用于擴增棉鈴蟲的MEP基因，并表達了5個MEP基因（MEP1-MEP5），在體外蛋白質(zhì)誘導(dǎo)研究中觀察到這5個MEP基因在不同皮膚真菌中的表達差異，提示它們的功能和蛋白水解能力不同，MEP3在突變菌株中表現(xiàn)出最強的蛋白水解活性，尤其是對毛發(fā)生物降解能力和動物致病性較強[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸能使真菌中蛋白酶MEP、SUB基因表達量下降，可通過抑制真菌中蛋白酶MEP、SUB基因表達來發(fā)揮其抗真菌作用。

[參考文獻]

[1]? Wang D，Chen Q，Liu B，et al. Ellagic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in human glioblastoma cells [J]. Acta Cir Bras，2016，31（2）：143-149.

[2]? Hagiwara Y，Kasukabe T，Kaneko Y，et al. Ellagic acid，a natural polyphenolic compound，induces apoptosis and potentiates retinoic acid-induced differentiation of human leukemia HL-60 cells [J]. Int J Hematol，2010，92（1）：136-143.

[3]? Selvadurai Muralidharan，Jaya Raja Kumar，Sokkalingam Arumugam Dhanara. Development and validation of an high-performance liquid chromatographic，and a ultraviolet spectrophotometric method for determination of Ambroxol hydrochloride in pharmaceutical preparations [J]. J Adv Pharm Technol Res，2013，4（1）：65-68.

[4]? Ferrell J，Sellers B，Leon R. Management of Spreading Pricklypear（Opuntia humifusa）with Fluroxypyr and Aminopyralid [J]. Weed Technol，2014，28（4）：734-738.

[5]? Li ZJ，Guo X，Dawuti G，et al. Antifungal Activity of Ellagic Acid In Vitro and In Vivo [J]. Phytother Res，2015， 29（7）：1019-1025.

[6]? Kaufman G，Horwitz BA，Duek L，et al. Infection stages of the dermatophyte pathogen Trichophyton： microscopic characterization and proteolytic enzymes [J]. Med Mycol，2007，45（2）：149-155.

[7]? Giddey K，F(xiàn)avre B，Quadroni M，et al. Closely related dermatophyte species produce different patterns of secreted? proteins [J]. FEMS Microbiol Lett，2007，267（1）：95-101.

[8]? Liang PP，Huang XZ，Yi JL，et al. A Trichophyton Rubrum Infection Model Based on the Reconstructed Human Epidermis-Episkin [J]. Chin Med J（Engl），2016，129（1）：54-58.

[9]? CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi;Approved Standard （M38-A）[M]. Pennsylvania：CLSI，2002.1.

[10]? Rudramurthy SM，Shankarnarayan SA，Dogra S，et al. Mutation in the Squalene Epoxidase Gene of Trichophyton interdigitale and Trichophyton rubrum Associated with Allylamine Resistance [J]. Antimicrob Agents Chemother，2018，62（5）：e02522-17.

[11]? Zaugg C，Monod M，Weber J，et al. Gene expression profiling in the human pathogenic dermatophyte Trichophyton rubrum during growth on proteins [J]. Eukaryot Cell，2009，8（2）：241-250.

[12]? Sato N，Tagami H. Severe measles in a young female patient with chronic，generalized Trichophyton rubrum infection showing type2 helper T cell-dominant immunologic reactivity [J]. Am Aead Dermatol，2003，48（5Supp1）：43-46.

[13]? Jousson O，Léchenne B，Bontems O，et al. Secreted subtilisin gene family in Trichophyton rubrum [J]. Gene，2004，339：79-88.

[14]? Okafor JI，Ada N. Keratinolytic activity of five human isolates of the dermatophytes [J]. J Commun Dis，2000，32（4）：300-305.

[15]? 李治建，趙明月，古力娜·達吾提，等.地錦草有效部位對紅色毛癬菌細胞膜合成及MEP、SUB基因表達的影響[J].藥學(xué)學(xué)報，2014，49（2）：273-276.

[16]? Viani FC，Dos Santos JI，Paula CR，et al. Production of extracellular enzymes by Microsporum canis and their role in its viru-lence [J]. Med Mycol，2001，39（5）：463-468.

[17]? Jousson O，Léchenne B，Bontems O，et al. Multiplication of an ancestral gene encoding secreted fungalysin preceded species differentiation in the dermatophytes Trichophyton and Microsporum [J]. Microbiology，2004，150（Pt 2）：301-310.

[18]? Zhang X，Wang Y，Chi W，et al. Metalloprotease genes of Trichophyton mentagrophytes are important for pathogenicity [J]. Med Mycol，2014，52（1）：36-45.

（收稿日期：2019-09-30? 本文編輯：顧家毓）