孫有良 王宇童

[摘要] 目的 比較超速離心法與純化試劑盒提取法提取血清外泌體的有效性與實(shí)用性，為后續(xù)外泌體相關(guān)研究提供借鑒。 方法 將12只6～8周C57BL/6雄性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組6只，即超速離心法提取組及純化試劑盒提取組。分別用兩種方法分離小鼠血清中的外泌體。使用納米粒度及zeta電位儀（Nano ZS90）檢測(cè)兩組外泌體的粒徑大小及分布;使用透射電子顯微鏡觀察兩種方法提取外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu);采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平;對(duì)兩種方法所提取外泌體中的核糖核酸（RNA）分離鑒定，比較兩種方法提取外泌體中RNA的異同。 結(jié)果 兩組所得的外泌體直徑為30～150 nm，形態(tài)均為脂質(zhì)雙分子層囊泡樣，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示兩組外泌體均表達(dá)標(biāo)志蛋白cluster of differentiation 63和tumor susceptibility gene，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與純化試劑盒提取組比較，超速離心法提取組的外泌體濃度更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且超速離心法提取組中外泌體所含RNA以microRNA為主，而純化試劑盒提取組的外泌體中所含RNA主要為piRNA。 結(jié)論 超速離心法與純化試劑盒提取法均能有效提取外泌體，但所得到的外泌體包含不同RNA成分，為外泌體的研究提供更有效的選擇方法。

[關(guān)鍵詞] 小鼠血清;外泌體;超速離心法;純化試劑盒提取法

[中圖分類號(hào)] Q26? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（a）-0004-04

[Abstract] Objective To compare the effectiveness and practicability of extraction of serum exosomes by ultracentrifugation and purification kit， and to provide references for subsequent exosome studies. Methods Twelve C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were divided into two groups by random table method， with 6 mice in each group， that was the ultracentrifugation extraction group and the purification kit extraction group. Exosomes in mouse serum were isolated by two methods. The particle size and distribution of exosomes in the two groups were detected by Nano particle size and zeta potentiometer（Nano ZS90）. The morphological structures of exosomes were extracted by transmission electron microscopy. Western blot was used to detect the expression level of exosome marker proteins. Ribonucleic acid （RNA） was isolated and identified from exosomes extracted by the two methods. Results The outside diameter of the proceeds of two groups was 30-150 nm， and morphology was lipid bilayer vesicle. Western blot results showed that the exosomes in both groups expressed the marker protein cluster of differentiation 63 and tumor susceptibility gene， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the purification kit extraction group， the ultracentrifugation extraction group had a higher exosomes concentration， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Moreover， the RNA in the exosomes in the ultracentrifugation extraction group was mainly microRNA， while the RNA in the exosomes in the purification kit extraction group was mainly piRNA. Conclusion The ultracentrifugation and purification kit extraction method can both effectively extract exosomes， but the exosomes obtain different RNA components， which provides a more effective selection method for the study of exosomes.

[Key words] Mouse sera; Exosomes; Ultracentrifugation; Purification kit extraction method

外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)，直徑介于30～150 nm之間，可存在于血清、唾液、尿液等多種體液中[1-3]。外泌體是細(xì)胞間的一種新型通訊方式，可以影響機(jī)體的多種生理病理過(guò)程，如機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方面，因而近年外泌體的相關(guān)研究呈現(xiàn)“井噴式”增加[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)容物極其豐富，包含核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、蛋白和脂類[8-9]。其中，一些表達(dá)于外泌體的特異性蛋白標(biāo)志物如cluster of differentiation 63（CD63）、tumor susceptibility gene（TSG101）和hot shock protein 70（HSP70）等可以用于外泌體的鑒定[10-11]。對(duì)外泌體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的開發(fā)都需要快速有效的分離方法，目前主要包括超速離心法、外泌體純化試劑盒提取法以及聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）沉淀法[12-14]，但均未形成標(biāo)準(zhǔn)化體系，更鮮有研究比較這些方法的效率和實(shí)用性。本文旨在比較通過(guò)超速離心法及純化試劑盒提取法從小鼠血清樣品中提取外泌體的實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)用性及有效性，并充分考慮了其在臨床實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)療點(diǎn)設(shè)置中的優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)外泌體的研究和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6～8周C57BL/6雄性小鼠由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，使用合格證號(hào)：SYXK（京）2018-0003]。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫18～23℃，相對(duì)濕度45%～55%。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為兩組，每組6只，即超速離心法提取組及純化試劑盒提取組。

1.2 儀器與材料

CD63抗體（批號(hào)：25682-1-AP）、TSG101抗體（貨號(hào)：ab125011）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS外泌體純化試劑盒（批號(hào)：293-77601）購(gòu)于北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;QIAGEN抽提試劑盒（批號(hào)：217184）、PKH67綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記試劑盒（批號(hào)：PKH67GL-1KT）購(gòu)于泰科蘭博（北京）生物有限公司;納米粒度及zeta電位儀（Nano ZS90）購(gòu)于英國(guó)馬爾文公司;LE-80 Ultracentrifuge 低溫超速離心機(jī)（ITEM：24830）購(gòu)于美國(guó)Beckman公司，轉(zhuǎn)子半徑11.1 cm;透射電鏡（Tecnai G2 spititi）購(gòu)于美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 超速離心法提取外泌體? 以尾靜脈取血法分別從兩組小鼠體內(nèi)收集2 mL血清樣品，加入13 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），300 g，4℃，離心10 min（離心機(jī)半徑11.1 cm）。取上清，12 000 g，4℃，離心40 min。取上清，通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾。超速離心120 000 g，4℃，離心1.5 h，棄上清。沉淀用15 mL PBS溶液吹打洗滌，100 000 g，4℃，離心1 h，沉淀為外泌體。

1.3.2 純化試劑盒提取外泌體? 首先用固定緩沖液清洗60 μL 磁珠，掌式離心機(jī)離心1 min，去除上清，分別添加500 μL固定緩沖液及10 μL Biotin-labeled Exosome Capture。在2～10℃條件孵育10 min，離心去除緩沖液后用固定緩沖液清洗兩次。向樣品中添加binding enhancer及磁珠，在2～10℃條件下孵育3 h，去除溶液。預(yù)先準(zhǔn)備洗滌緩沖液，添加binding enhancer，清洗磁珠，重復(fù)3次。添加50 μL elution buffer到清洗過(guò)的外泌體結(jié)合磁珠的反應(yīng)管中，渦旋，室溫靜置10 min。離心后收集得到含外泌體的溶液。

1.3.3 外泌體粒徑分析? 吸取10 μL上述提取的外泌體樣本，用PBS稀釋為1 mL，用納米粒度及ZETA電位儀進(jìn)行測(cè)試。

1.3.4 透射電鏡成像? 將外泌體樣本離心，吸取15 μL外泌體樣本于銅網(wǎng)上靜置1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，然后吸取15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，觀察拍照。

1.3.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)? 向上述提取的外泌體懸液中添加上樣緩沖液，95℃加熱10 min變性。每個(gè)上樣孔添加20 μg蛋白樣品在10%丙烯酰胺凝膠中電泳2 h，電泳后使用電轉(zhuǎn)儀2 h把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，在搖床孵育1 h，在4 ℃條件下孵育CD63、TSG101 以及HSP70一抗16 h，再隔日加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，在蛋白成像系統(tǒng)中曝光成像。

1.3.6 外泌體所包含RNA的濃度檢測(cè)? 將小鼠血清樣本溶于QIAzol Lysis Reagent中，加入氯仿，冰上靜置10 min，12 000 g，4℃，離心15 min。提取上層水相，加入乙醇。樣品再加入RNeasy MinElute離心柱，總RNA被結(jié)合到膜上。然后使用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)? 將PKH67和稀釋液按1∶50的比例配20 μL，PBS稀釋成200 μL，PKH67和外泌體混勻室溫孵育10 min。加細(xì)胞培養(yǎng)基終止標(biāo)記反應(yīng)。12 000 g，4℃，離心30 min，棄上清，加PBS重懸。12 000 g，4℃，離心30 min，棄上清加細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。共聚焦小皿棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基加入含有外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)基。24 h后加入4%多聚甲醛固定30 min，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核，30 min后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 外泌體包含RNA的分析? 將超速離心法提取組與外泌體純化試劑盒提取組的外泌體行轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序，對(duì)兩組中外泌體包含的RNA進(jìn)行初步分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體粒徑分析

粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組方法所提取的外泌體粒徑大小較集中，超速離心法提取組外泌體粒徑[（69.24±1.12）nm]與純化試劑盒提取組外泌體粒徑[（74.34±0.98）nm]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 透射電鏡結(jié)果

透射電鏡結(jié)果顯示，兩組所提取的外泌體在鏡下均呈一側(cè)凹陷的半球形雙層膜囊泡，囊泡直徑在30～150 nm之間。見圖2。

2.3 外泌體標(biāo)志蛋白的檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示，兩種方法所提取組的外泌體均能檢測(cè)到CD63和TSG101等外泌體標(biāo)志蛋白，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 外泌體所含RNA濃度檢測(cè)分析

RNA濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，超速離心法提取組的RNA濃度低于純化試劑盒提取組提取的RNA濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4A～B（封三）。標(biāo)記綠色熒光的PKH67是外泌體表面的標(biāo)志蛋白，免疫熒光結(jié)果顯示，超速離心法提取組外泌體數(shù)量低于純化試劑盒提取組提取的外泌體數(shù)量，見圖4C～D（封三）。與純化試劑盒提取組比較，超速離心法提取組外泌體RNA濃度較低（P < 0.05），總量較低（P < 0.05），microRNA含量較高（P < 0.05）。見表1。

2.5 外泌體所含RNA分析

測(cè)序結(jié)果顯示，超速離心法提取組的外泌體所含RNA大小主要集中在20～23 nt，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較，進(jìn)一步分析RNA種類主要為microRNA。而純化試劑盒提取組的外泌體中所含RNA的大小集中在28～33 nt，RNA的種類主要為piRNA。見圖5（封三）。

3 討論

20世紀(jì)80年代外泌體發(fā)現(xiàn)初期，研究者認(rèn)為其僅僅用于攜帶細(xì)胞代謝被排出體外[15]。隨著研究的深入，人們對(duì)外泌體的功能有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，研究發(fā)現(xiàn)其在介導(dǎo)細(xì)胞通訊以及疾病診斷的過(guò)程中發(fā)揮著獨(dú)到的作用[16-18]。與傳統(tǒng)的診斷手段比較，外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物對(duì)患者的創(chuàng)傷更小，診斷樣本更容易獲取。外泌體也可以作為靶向藥物的載體發(fā)揮作用，通過(guò)囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞綄⑺幬镞\(yùn)輸?shù)桨卸ǖ奈恢肹19-20]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)外泌體的提取方法各異并且每種方法都存在優(yōu)缺點(diǎn)，如何從各種方法中挑選能夠滿足自身實(shí)驗(yàn)要求的方法是各位研究者共同關(guān)心的問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，超速離心法、外泌體純化試劑盒提取法均能夠在小鼠血清中成功提取外泌體。本研究發(fā)現(xiàn)超速離心法提取的外泌體包含的小RNA種類主要為microRNA，而純化試劑盒提取的外泌體包含的小RNA種類主要為piRNA，而造成這一差異的原因仍有待于進(jìn)一步研究。這一結(jié)果對(duì)今后需要檢測(cè)外泌體中RNA成分的研究者具有一定的借鑒意義。綜上所述，兩種方法都能夠從小鼠血清中成功提取外泌體，但外泌體包含的成分明顯不同，故后續(xù)更關(guān)注外泌體中microRNA的功能則應(yīng)選擇超速離心法分離，而后續(xù)研究更關(guān)注piRNA則應(yīng)主要采用純化試劑盒提取外泌體。當(dāng)然，在進(jìn)行外泌體研究時(shí)也需考慮實(shí)驗(yàn)室的具體條件，超速離心法對(duì)設(shè)備要求高，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，但所得外泌體純度較高，適用于對(duì)外泌體純度要求更加精確的相關(guān)機(jī)制研究。純化試劑盒提取法的操作步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短，可同時(shí)處理較多的樣品，適用于對(duì)外泌體純度要求不高但容量較大的樣品。

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（收稿日期：2019-11-28? 本文編輯：劉永巧）