申志華，黃薩礎(chǔ)拉，#，馬秀梅*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

乙酰肝素酶(heparitinase)是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一能切割細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中硫酸乙酰肝素的內(nèi)源性糖苷酶[1]。研究顯示，乙酰肝素酶的高表達(dá)與胃癌侵襲程度密切相關(guān)，與脈管內(nèi)瘤栓、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高臨床分期和高微血管密度有關(guān)[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞失去其形態(tài)和功能后，逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程，伴隨相關(guān)基因表達(dá)的改變，此改變常伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志物鈣黏蛋白(E-cadherin)、上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、細(xì) 胞角蛋白(cytokeratin，CK)表達(dá)減少和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)纖維連接蛋白表達(dá)增加。EMT是癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[3-4]，由絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKS)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、FAS 信號通路等多種細(xì)胞傳導(dǎo)途徑激活，及E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)的改變將對胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移，早期診斷有重要意義[5]。本實(shí)驗(yàn)通過研究人胃癌組織中乙酰肝素酶、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)情況與人胃癌組織臨床病理特征的關(guān)系以及它們之間的相關(guān)性，探討胃癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015—2017年手術(shù)切除標(biāo)本，病例資料完整并經(jīng)病理醫(yī)師診斷為胃癌的病例91例，所有患者均知情同意，且本研究已獲得該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。標(biāo)本中年齡最小者24歲，最大者81 歲；男性71 例，女性20 例；腫瘤最大者15 cm，最小者直徑為0.4 cm；低分化41例，中-低分化37例，高-中分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例；腫瘤位于賁門26 例，胃體30 例，胃竇及幽門35例。

1.2 主要試劑

E-cadherin 兔抗人多克隆抗體、β-catenin 兔抗人多克隆抗體、N-cadherin兔抗人多克隆抗體、vimentin兔抗人多克隆抗體，均購自博奧森生物技術(shù)公司。即用型SP 試劑盒、DAB 顯色劑，均購自邁新生物技術(shù)公司。

采用4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟和水化。3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，采用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH=6.4)在800 W 微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，每次3 min，間隔1 min。分別加入兔抗人多克隆抗體HPA (1∶100 稀 釋)、E-cadherin(1∶250 稀 釋)、Ncadherin (1∶250 稀釋)和vimentin(1∶100 稀釋)4 ℃孵育過夜。然后加入IgG(HRP復(fù)合體在37 ℃恒溫箱孵育30 min。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。每次以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性反應(yīng)切片作為陽性對照。

1.3 對照設(shè)置及結(jié)果判定

兩名病理醫(yī)師按半定量評分方法獨(dú)立評分：每例切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，無色計(jì)為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)≤5%時(shí)計(jì)為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞數(shù)得分相乘。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HPA、E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達(dá)率與人胃癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，胃癌起始部位與侵襲深處表達(dá)情況，采用卡方檢驗(yàn)；HPA蛋白在人胃癌中陽性表達(dá)率與E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達(dá)率的相關(guān)性，采用Spearman 等級相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 HPA、E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白在胃癌中的表達(dá)

91 例人胃癌組織中HPA 蛋白陽性表達(dá)率75.82%，主要定位在人胃癌細(xì)胞胞漿(圖1)；Ecadherin 蛋白陽性表達(dá)率為51.65%，主要在高分化胃癌細(xì)胞胞膜高表達(dá)，低分化胃癌中低表達(dá)(圖2)；Ncadherin蛋白陽性表達(dá)率為54.95%，vimentin蛋白陽性表達(dá)率為23.08%，在癌細(xì)胞胞膜、胞漿均有所表達(dá)，且在低分化胃癌呈高表達(dá)(圖3、4)。

圖1 免疫組化染色顯示HPA 在中分化人胃癌細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈棕褐色(×400)

圖2 免疫組化染色顯示E-cadherin 在高分化胃癌細(xì)胞胞膜中表達(dá)，呈棕褐色(×400)

圖3 免疫組化染色顯示N-cadherin 在低分化胃癌中表達(dá)，呈棕褐色(×400)

圖4 免疫組化染色顯示vimentin 在低分化胃癌中表達(dá)，呈淡黃色(×400)

2.2 人胃癌組織中HPA 蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

人胃癌組織中HPA蛋白陽性表達(dá)率與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表1。HPA 蛋白陽性率在不同患者年 齡(χ2=0.124，F(xiàn)=0.725)、性別(χ2=0.009，P=0.922)和胃癌大小(χ2=0.018，P=0.892)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同發(fā)生部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中賁門部胃癌HPA蛋白陽性率為88.46%，胃體胃癌HPA 蛋白陽性率為86.67%，胃竇、幽門部胃癌HPA 陽性率為57.14%，賁門部胃癌HPA蛋白陽性率明顯高于胃體、胃竇及幽門部胃癌(χ2=10.852，P=0.004)；低分化胃癌HPA蛋白陽性率為92.68%，高/中分化胃癌HPA 蛋白陽性率為62%，低分化胃癌HPA蛋白陽性率明顯高于高、中分化胃癌(χ2=9.956，P=0.002)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HPA 蛋白陽性率為82.86%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HPA蛋白陽性率為52.38%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HPA蛋白陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=8.185，P=0.004)。

表1 HPA蛋白陽性表達(dá)率與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 人胃癌組織中E-cadherin 蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

人胃癌組織中E-cadherin 蛋白陽性表達(dá)率與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表2。E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率 在 不 同 患 者 年 齡(χ2=3.155，P=0.078)、性 別(χ2=0.454，P=0.501)、胃癌大小(χ2=0.043，P=0.836)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在不同胃癌發(fā)生部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。E-cadherin蛋白在賁門部胃癌患者中陽性率為34.62%，在胃體胃癌患者中陽性率為36.67%，胃竇、幽門部胃癌患者陽性率為74.14%，E-cadherin 在賁門部胃癌患者中陽性率明顯低于胃體、胃竇及幽門部(χ2=14.826，P=0.001)；高/中分化胃癌患者中陽性率為74%，低分化胃癌患者中陽性率為24.39%，高/中分化胃癌患者中陽性率明顯高于低分化者(χ2=22.201，P=0.000)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率為40%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率為90.48%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=14.522，P=0.000)。

表2 E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 人胃癌組織中N-cadherin 蛋白表達(dá)與臨床病理的指標(biāo)關(guān)系

N-cadherin 蛋白在人胃癌組織中陽性表達(dá)率為54.95%，在不同患者年齡(χ2=0.009，P=0.925)、性別(χ2=1.024，P=0.312)、胃癌大小(χ2=1.138，P=0.286)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在不同發(fā)生部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。N-cadherin蛋白在賁門部胃癌患者中陽性率為69.23%，胃體胃癌患者中陽性率為66.67%，胃竇、幽門部胃癌患者中陽性率為34.29%，N-cadherin蛋白在賁門部胃癌患者中陽性率明顯高于胃體，胃竇及幽門部患者，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(χ2=9.843，P=0.007)；N-cadherin蛋白在低分化胃癌患者中陽性率為68.29%，高/中分化胃癌患者中陽性率為44%，低分化胃癌患者中陽性率明顯高于高/中分化者，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.370，P=0.02)；N-cadherin 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率為65.71%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率為19.05%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.211，P=0.00)。詳情見表3。

2.5 人胃癌組織中vimentin蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

Vimentin 蛋白在人胃癌組織中表達(dá)為23.08%，在不同 患者 年 齡(χ2=0.443，P=0.506)、性 別(χ2=0.053，P=0.817)、胃癌大小(χ2=0.040，P=0.841)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在不同發(fā)生部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中vimentin 蛋白在賁門胃癌患者中陽性率為30.77%，胃體胃癌病例中vimentin 蛋白陽性率為30.00%，胃竇、幽門部胃癌患者中陽性率為11.43%，賁門胃癌患者中陽性率明顯高于胃體、胃竇及幽門部，差 別 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(χ2=10.195，P=0.006)；vimentin 蛋白在高/中分化胃癌患者中陽性率為12%，低分化胃癌患者中陽性率為36.59%，高/中分化胃癌患者中陽性率明顯低于低分化著，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.671，P=0.006)；vimentin 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中陽性率為28.57%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中陽性率為4.76%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.905，P=0.048)。詳細(xì)結(jié)果見表4。

表3 N-cadherin的表達(dá)與胃癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

表4 vimentin蛋白在人胃癌組織中的陽性表達(dá)率與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.6 HPA、E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白在胃癌原發(fā)灶與侵襲深處的表達(dá)

HPA、E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白在胃癌原發(fā)灶與侵襲深處表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中HPA 蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率為75.82%，在胃癌侵襲深處陽性率為87.91%，HPA在胃癌原發(fā)灶陽性率明顯低于胃癌侵襲深處(χ2=4.479，P=0.027)。E-cadherin 蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率為51.65%，在胃癌侵襲深處陽性率為36.26%，E-cadherin 蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率明顯高于胃癌侵襲深處(χ2=4.372，P=0.026)。N-cadherin 蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率為54.95%，在胃癌侵襲深處陽性率為73.63%，Ncadherin蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率明顯低于胃癌侵襲深處(χ2=6.916，P=0.013)。vimentin 蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率為23.08%，在胃癌侵襲深處陽性率為38.46%，vimentin蛋白在胃癌原發(fā)灶陽性率明顯低于胃癌侵襲深處(χ2=5.056，P=0.025)。詳情見圖5～8和表5。

圖5 免疫組化染色顯示HPA在胃癌侵襲深處陽性表達(dá)(×400)

圖6 免疫組化染色顯示E-cadherin 在胃癌侵襲深處表達(dá)，呈棕黃色(×400)

圖7 免疫組化染色顯示N-cadherin 在胃癌侵襲深處表達(dá)，呈棕褐色(×400)

表5 胃癌原發(fā)灶與侵襲深處HPA、E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)

圖8 免疫組化染色顯示vimentin 在胃癌侵襲深處表達(dá)，呈棕黃色(×400)

2.7 人胃癌組織中HP 與E-cadherin、HPA 與Ncadherin、HPA與vimentin蛋白相互關(guān)系

在人胃癌細(xì)胞中，HPA、E-cadherin、N-cadherin和vimentin 蛋白的表達(dá)與人胃癌組織的位置、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析(表6)顯示HPA、E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白之間也存在相關(guān)性，HPA與Ecadherin蛋白在胃癌組織中陽性率呈負(fù)相關(guān)性，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.341，P=0.005)。HPA 與N-cadherin 蛋白在人胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.366，P=0.001)，HPA 與vimentin 蛋白在人胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.248，P=0.038)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 HPA與E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

HPA主要在造血細(xì)胞和胎盤中表達(dá)，其他組織未見，而在很多腫瘤組織，乙酰肝素酶mRNA 和蛋白質(zhì)均呈高表達(dá)，而腫瘤周圍正常組織檢測不到。一些學(xué)者研究顯示，HPA的高表達(dá)與結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌和宮頸癌等惡性腫瘤的高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高微血管密度和預(yù)后差有關(guān)。因HPA的存在細(xì)胞更易于被轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞入侵[6]。沉默HPA基因可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與HPA 蛋白基因可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)人胃癌組織中HPA、N-cadherin 和vimentin 蛋白在低分化者明顯高于高分化者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，可見HPA、Ncadherin和vimentin蛋白與胃癌惡性程度高，侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。E-cadherin 蛋白在高中分化胃癌者陽性表達(dá)率明顯高于低分化胃癌者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。可見E-cadherin 蛋白與胃癌惡性程度高，侵襲、轉(zhuǎn)移無關(guān)。Yang 等[8]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HPA 蛋白除通過降解HS 促進(jìn)腫瘤進(jìn)展外，還通過增加syndecan-1 從腫瘤細(xì)胞表面脫落促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，其機(jī)制可能增強(qiáng)細(xì)胞的黏附性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(如蛋白激酶B/AKT、Src、表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子和胰島素受體通路)等途徑來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

EMT 是腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵事件[9]，伴隨著各種蛋白標(biāo)志物的改變與相關(guān)信號通路的激活和抑制。Ecadherin 蛋白減少或丟失及N-cadherin、vimentin 蛋白表達(dá)增強(qiáng)是EMT 的標(biāo)志，本研究發(fā)現(xiàn)HPA、Ncadherin和vimentin蛋白陽性表達(dá)率在侵襲深處明顯高于起始部位，可見這3 種蛋白與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)；E-cadherin 蛋白陽性表達(dá)率在侵襲深處明顯低于原發(fā)灶，可見E-cadherin 蛋白缺失或者減少，與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移無關(guān)。因此，胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生著EMT。EMT是指上皮細(xì)胞能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)演變成間質(zhì)細(xì)胞過程，也是癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落轉(zhuǎn)移的過程，眾多相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等許多來源于上皮的腫瘤，均常常發(fā)生E-cadherin 蛋白表達(dá)的缺失或減少[10]。研究還表明N-cadherin 蛋白的上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[11]。Ecadherin 蛋白減少和N-cadherin、vimentin 蛋白增加隨后發(fā)生EMT的潛在分子機(jī)制尚未研究清楚。近期，有些學(xué)者研究顯示，纖維母細(xì)胞生長因子-2(fibrolast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT中HPA蛋白是必需的。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化學(xué)方法檢測了人胃癌組織中HPA、E-cadherin、Ncadherin、vimentin 蛋白與不同病理指標(biāo)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)HPA 與N-cadherin、HPA 與vimentin 蛋 白 呈 正 相 關(guān)，而與E-cadherin 蛋白呈負(fù)相關(guān)，所以HPA蛋白可能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。Zhang 的研究證實(shí)了EMT 與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。對于HPA蛋白通過何種調(diào)節(jié)途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT 促使胃癌發(fā)生浸潤，轉(zhuǎn)移的機(jī)制還需深入研究。這將為胃癌特異性治療提供新的思路和依據(jù)，具有廣泛的臨床意義和良好的應(yīng)用前景。本研究還存在一定的不足和局限性，選取樣本量較小，對于患者HPA、E-cadherin、N-cadherin、Vimientin 蛋白與其臨床病理特征相關(guān)研究不夠完善，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，增加相關(guān)性研究的深度。

有研究表明，通過阻斷HPA 蛋白抑制胃癌發(fā)生EMT途徑，有望抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。我們的下一步研究是關(guān)于HPA蛋白誘導(dǎo)胃癌發(fā)生EMT的機(jī)制。EMT賦予腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲能力的啟動(dòng)步驟，為腫瘤細(xì)胞穿透基底膜、通過血液和淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端組織器官提供了前提條件，獲得遷移能力的腫瘤細(xì)胞對放化療的耐受性也增加，進(jìn)而增加了術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。