孫嬌嬌，車碧眾，羅秋林，翟兵中，信麗麗*

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 蘇州215123)

近年來，隨著霧霾天氣的頻發(fā)，大氣顆粒物對健康造成的危害已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點。細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm 的顆粒物，其粒徑小、比表面積大，且易吸附有毒有害物質(zhì)并能沉積在呼吸系統(tǒng)深部，甚至可穿透肺泡到達血液循環(huán)系統(tǒng)，從而對機體產(chǎn)生健康損害效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可引起活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成、炎癥因子釋放及胞內(nèi)抗氧化酶活性下降，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡。氧化-抗氧化系統(tǒng)紊亂可進一步誘發(fā)蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，進而損傷溶酶體、線粒體等細胞器，導(dǎo)致細胞功能障礙，進而損傷呼吸系統(tǒng)[1]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，維生素D作為機體內(nèi)重要的維生素，不僅可發(fā)揮經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用，還可參與調(diào)控細胞氧化應(yīng)激損傷。研究表明，包括呼吸道上皮細胞在內(nèi)的幾乎所有真核細胞均可表達維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)，且胞內(nèi)存在1α-羥化酶，可通過自分泌和旁分泌的方式在局部合成活性維生素D3[1,25-(OH)2D3][2]。1,25-(OH)2D3可參與調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)和細胞增殖活性等，幫助維持機體氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，保護細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞膜免受氧化損傷，以此減輕多種應(yīng)激因素對細胞的損傷效應(yīng)[3-4]。HBE細胞來源于正常人的支氣管上皮細胞，在原代培養(yǎng)時經(jīng)轉(zhuǎn)染而永生化，現(xiàn)被廣泛用于支氣管上皮細胞和呼吸系統(tǒng)的研究。因此，本研究采集蘇州市工業(yè)園區(qū)居民生活區(qū)大氣中PM2.5顆粒物，并以HBE細胞為實驗對象。PM2.5混懸液染毒和1,25-(OH)2D3干預(yù)后，分別測定細胞存活率、MDA 含量、GSH/GSSG 比值和抗氧化蛋白的表達水平，探討1,25-(OH)2D3對PM2.5所致細胞氧化損傷可能的保護作用。

1 對象與方法

1.1 儀器與試劑

細胞恒溫培養(yǎng)箱，購于美國Thermo 公司；CKX41SF 型倒置顯微鏡，購于日本Olympus 公司；粉塵采樣器GilAir-5，購于美國Sensidyne 公司；多功能酶標儀Synergy 2，購于美國Bio-Tek 公司；G：BOX Chemi XRQ 凝膠成像儀，購于英國Syngene 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，購于美國HyClone 公司；胎牛血清，購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，購于中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1,25 二羥基維生素D3，購于美國Sigma-Aldrich 公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒，購于中國南京建成生物工程研究所；GSH/GSSG-GloTM試劑盒，購于美國Promega公司。

1.2 PM2.5采集和成分分析

在蘇州市工業(yè)園區(qū)居民生活區(qū)用TH-150C中流量大氣采樣器將空氣中的PM2.5采集于Teflon濾膜上，采樣流量為100 L/min，采樣時間為8 h，連續(xù)采樣1周，取單日PM2.5濃度最高的樣品進行后續(xù)毒理學(xué)檢測實驗。對本次采集的PM2.5進行成分分析，發(fā)現(xiàn)其粒徑主要集中分布在0.1～0.2 μm 范圍內(nèi)，無機元素Mg、Al、Cu、Zn 和Pb 的含量較高，其中Al 濃度最高為348.78 ng/m3，Cu為222.58 ng/m3；水溶性離子濃度μg/m3， CCl-=4.5 μg/m3， CK+=0.9 μg/m3， CNa+=0.4 μg/m3；此外，對該樣本中的多環(huán)芳烴進行定量分析，共檢測到25 種多環(huán)芳烴，其中熒蒽濃度最高為11.033 ng/m3，芘為9.213 ng/m3，菲為7.385 ng/m3[5]。

1.3 PM2.5混懸染毒液的制備

用超純水洗脫濾膜，冰水浴超聲4 h。真空冷凍干燥并稱重后，將PM2.5顆粒物置于超凈臺紫外線燈下照射過夜。PBS 溶解并渦旋混勻后獲得PM2.5混懸儲備液(每毫升PBS中含有20 mg PM2.5顆粒物)。

1.4 1,25-(OH)2D3溶液制備

將0.1 mg 1,25-(OH)2D3(相對分子質(zhì)量為416.64)溶解于1 mL 95%的乙醇中，得到濃度為2.4×10-4mol/L的1,25-(OH)2D3溶液。然后，將100 μL 1,25-(OH)2D3溶液加入到23.9 mL 95%乙醇中，得到濃度為1×10-6mol/L的1,25-(OH)2D3儲備液，-20 ℃避光保存。

1.5 HBE細胞培養(yǎng)與處理

將HBE細胞接種于培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，隨后均勻接種到96 孔板(用于細胞存活率和GSH/GSSG 比值測定)和6 孔板(用于MDA 濃度和蛋白表達水平測定)。

1,25-(OH)2D3的細胞干預(yù)實驗研究中，一般采取的是1×10-7、1×10-8(最接近人體內(nèi)維生素D水平)和1×10-9mol/L 三種濃度。而我們的預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×10-8mol/L 1,25-(OH)2D3可將HBE 細胞存活率降低至80%左右，在此基礎(chǔ)上，我們參照以往的多項研究選擇了1×10-9mol/L作為本研究的干預(yù)劑量。

根據(jù)處理因素不同將細胞分為4組：溶劑(乙醇)對照組、1,25-(OH)2D3干預(yù)組、乙+PM2.5染毒組、PM2.5染毒+1,25-(OH)2D3干預(yù)組。溶劑對照組細胞用0.1%乙醇處理48 h，1,25-(OH)2D3干預(yù)組用1×10-9mol/L 的1,25-(OH)2D3處理48 h，乙醇+PM2.5染毒組用0.1%乙醇溶劑處理24 h 后更換為含乙醇的PM2.5(200 μg/mL)染毒液繼續(xù)處理24 h，PM2.5染毒+1,25-(OH)2D3干預(yù)組用1×10-9mol/L 1,25-(OH)2D3預(yù)處理24 h 后更換為含1,25-(OH)2D3的PM2.5(200 μg/mL)染毒液繼續(xù)處理24 h，每組設(shè)立3個平行樣。

1.6 細胞存活率測定

采用CCK-8 試劑盒測定96 孔板中細胞存活率。以對照組細胞為參照，計算染毒組細胞的相對存活率。

染毒組細胞相對存活率/%=D(450)染毒組/D(450)對照組×100%

1.7 MDA濃度測定

采用細胞MDA 試劑盒測定細胞裂解液中MDA 濃度。按照試劑盒的方法進行操作，結(jié)果計算時需用不同組細胞的蛋白濃度進行校正。MDA 濃度用nmol/mL來表示。

1.8 谷胱甘肽含量測定

采用GSH/GSSG-GloTM試劑盒測定GSH/GSSG 的比值。具體方法為：PM2.5染毒結(jié)束后棄去染毒液，每孔加入50 μL GSH 或GSSG 裂解液，室溫振蕩混勻5 min。然后，每孔均加入50 μL 熒光素生成試劑，室溫振蕩混勻30 min。隨后，每孔加入100 μL 熒光素檢測試劑。室溫平衡15 min 后，使用Synergy 2 多功能酶標儀測定細胞的化學(xué)發(fā)光值(luminscence，用RLU表示)。所有處理細胞組減去無細胞對照組的平均背景發(fā)光值，以得到每個處理組細胞的凈發(fā)光值。

GSH/GSSG 比值=(總GSH 凈發(fā)光值-GSSG 凈發(fā)光值)/(GSSG凈發(fā)光值/2)

1.9 Western blot檢測

提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。參照試劑盒(SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天)操作說明配制SDS-PAGE 凝膠，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 振蕩洗滌，二抗37 ℃振蕩孵育1 h。TBST振蕩洗滌后滴加化學(xué)發(fā)光試劑，用G：BOX Chemi XRQ 凝膠成像儀進行顯影并采用Image J 軟件進行灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以α=0.05為檢驗水準。

圖1 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細胞存活率的影響

2 結(jié) 果

2.1 1,25-(OH)2D3降低HBE細胞存活率

CCK-8 試劑盒檢測各組細胞存活率的結(jié)果見圖1。與對照組相比，1,25-(OH)2D3處理組HBE細胞的存活率下降；PM2.5染毒HBE 細胞24 h 后，細胞的存活率也顯著下降(P 均＜0.01)。然而，與PM2.5染毒組相比，1,25-(OH)2D3干預(yù)處理并不能改善PM2.5對細胞增殖的抑制作用，反而進一步降低了細胞的存活率(P＜0.01)。

2.2 1,25-(OH)2D3改善PM2.5誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)

用MDA 試劑盒和GSH/GSSG-GloTM試劑盒分別測定MDA濃度和GSH/GSSG比值，來反映細胞的氧化與抗氧化水平，結(jié)果見圖2。與對照相比，PM2.5染毒后，細胞MDA 的濃度顯著增加(P＜0.05，圖2A)，而GSH/GSSG 的比值卻明顯降低(P＜0.01，圖2B)。然而，1,25-(OH)2D3處理可降低MDA 水平并可增加細胞的GSH/GSSG 比值(P＜0.05)。此外，PM2.5染毒的細胞經(jīng)1,25-(OH)2D3處理48 h 后，MDA 濃度明顯降低，GSH/GSSG 比值顯著增加，且其指標的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。以上結(jié)果顯示，1,25-(OH)2D3可降低PM2.5所致HBE細胞的氧化應(yīng)激水平。

圖2 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細胞氧化和抗氧化水平的影響

2.3 1,25-(OH)2D3上調(diào)HBE細胞Nrf-2和HO-1蛋白的表達

Western blot實驗的條帶和灰度值分析結(jié)果分別見圖3 和圖4。與對照組相比，1,25-(OH)2D3處理48 h后，HBE 細胞VDR 的表達水平明顯增加(P＜0.01)。PM2.5染毒后HBE 細胞內(nèi)發(fā)揮重要抗氧化作用的Nrf-2和HO-1 蛋白的表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。1,25-(OH)2D3干預(yù)后，可發(fā)現(xiàn)HBE細胞內(nèi)Nrf-2 和HO-1 的表達也顯著增加(P＜0.05 或0.01)，但與乙醇+PM2.5染毒細胞組相比，蛋白表達水平的改變并無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE 細胞Nrf-2、HO-1 和VDR 蛋白表達的影響

圖4 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細胞Nrf-2、HO-1和VDR蛋白的相對表達水平的影響

3 討 論

PM2.5主要來源于汽車尾氣、道路灰塵以及工業(yè)生產(chǎn)廢氣的排放，被吸入人體后，可沉積在支氣管、細支氣管和肺泡，并造成肺部損傷，而其成分中危害較大的主要是重金屬離子、多環(huán)芳烴和硫酸鹽等[6]。大量研究表明，氧化應(yīng)激是PM2.5造成機體損傷的重要機制之一[7]。作為機體內(nèi)重要的類固醇類激素，維生素D發(fā)揮著重要作用。除經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用外，維生素D 可在多種細胞和組織中發(fā)揮抑制細胞增殖、誘導(dǎo)分化、抑制血管生成和促進細胞凋亡等廣泛的骨外生物學(xué)效應(yīng)[8-9]。此外，維生素D還可通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除細胞內(nèi)過氧化物而降低細胞氧化應(yīng)激水平[10]。因此，本研究從1,25-(OH)2D3可降低細胞氧化應(yīng)激水平的角度出發(fā)，探討其對PM2.5所致HBE細胞氧化損傷的潛在保護作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)HBE細胞氧化損傷，主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化水平升高、GSH/GSSG比值下降和抗氧化蛋白Nrf-2與HO-1 表達水平增加。在PM2.5所致細胞氧化應(yīng)激效應(yīng)中，1,25-(OH)2D3對細胞起到了一定的保護作用，這可能與VDR及Nrf-2/HO-1信號通路有關(guān)。

我們對所采集的居民生活區(qū)PM2.5顆粒物樣本進行成分分析后發(fā)現(xiàn)，Mg、Al、Cu、Zn 等金屬元素的含量較高，并可檢測出較高濃度的多環(huán)芳烴類物質(zhì)[5]。研究表明，PM2.5中含有Fe、Pb、Al、Mn、Zn 等多種共價金屬，可參與氧化還原反應(yīng)并誘導(dǎo)自由基的生成[11-12]。此外，顆粒物表面吸附的多環(huán)芳烴類物質(zhì)也可經(jīng)酶促反應(yīng)代謝活化而誘導(dǎo)生成ROS[13-14]。當過量的ROS 超過機體抗氧化系統(tǒng)對自由基的清除能力時，細胞氧化還原的平衡狀態(tài)將會被打破，從而產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)[15]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)HBE細胞出現(xiàn)氧化損傷，主要表現(xiàn)為MDA 濃度的升高和GSH/GSSG 比值的降低，這與以往的研究結(jié)果基本一致[16]。而結(jié)合我們PM2.5樣本的成分分析結(jié)果，PM2.5上附著的有機多環(huán)芳烴及過渡金屬成分可能是引起HBE細胞氧化損傷的重要原因。此外，1,25-(OH)2D3處理48 h可顯著降低PM2.5所誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激水平，與乙醇+PM2.5染毒組細胞相比，1,25-(OH)2D3+PM2.5處理組細胞內(nèi)MDA 濃度明顯降低，GSH/GSSG 比值也顯著增加。以上結(jié)果表明，1,25-(OH)2D3可降低細胞脂質(zhì)過氧化水平，并顯著提升HBE細胞的抗氧化水平。然而，與對照相比，1,25-(OH)2D3卻顯著降低了HBE 細胞的存活率，而對于PM2.5染毒組細胞，1,25-(OH)2D3的干預(yù)也進一步降低了細胞的存活率。以往的研究表明[17-18]，維生素D 有對小鼠成骨細胞和軟骨細胞增殖及人臍帶間充質(zhì)肝細胞增殖都具有抑制作用，且1,25-(OH)2D3可通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯或促進細胞凋亡而降低細胞的存活率和增殖活性[19-20]。因此，我們推測，本研究中1,25-(OH)2D3所致細胞存活率的降低可能與其誘導(dǎo)細胞周期阻滯及促進PM2.5所誘導(dǎo)的已損傷細胞的凋亡有關(guān)，但具體的研究機制有待進一步闡明。

研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3可通過以下幾種途徑降低氧化應(yīng)激對細胞造成的損傷：①1,25-(OH)2D3可通過抑制多種炎性因子合成及其生物活性來抑制炎癥反應(yīng)，進而阻止氧化應(yīng)激狀態(tài)下過量生成的ROS和炎癥反應(yīng)形成的惡性循環(huán)[21]；②因其與細胞膜結(jié)構(gòu)類似，1,25-(OH)2D3在細胞膜中積累可增強細胞膜流動性，保護細胞膜免受自由基引起的氧化損傷[22]；③1,25-(OH)2D3還可通過增加細胞內(nèi)的超氧化物歧化酶與過氧化氫酶等抗氧化酶的活性而降低細胞的氧化應(yīng)激水平。我們的結(jié)果表明，PM2.5染毒后，抗氧化蛋白Nrf-2 與HO-1 表達水平均明顯升高。1,25-(OH)2D3可顯著上調(diào)VDR 受體的表達水平，但對PM2.5染毒組細胞內(nèi)Nrf-2 與HO-1 的蛋白表達水平的上調(diào)幅度較小。這提示我們，PM2.5所致細胞氧化損傷及1,25-(OH)2D3的干預(yù)作用可能與VDR 受體的激活及Nrf-2 介導(dǎo)的防御機制的激活有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3進入細胞后可與VDR的配體區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)運至細胞核與靶基因的VDR反應(yīng)元件結(jié)合而調(diào)節(jié)多種氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。Keap1-Nrf2-ARE 通路是PM2.5誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2將轉(zhuǎn)移到細胞核，啟動下游HO-1 基因的表達。Nfr2/HO-1 信號軸可以通過抗氧化、抑制線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙等作用來抵御氧化應(yīng)激帶來的細胞損傷[23]。因此，本研究中1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE 細胞氧化損傷的保護作用可能與VDR 及Nrf-2/HO-1 通路的激活有關(guān)，但具體機制仍需深入研究。

綜上所述，PM2.5可誘導(dǎo)HBE 細胞產(chǎn)生氧化損傷，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA 濃度的升高和GSH/GSSG 比值的降低。此外，1,25-(OH)2D3干預(yù)可在一定程度上降低PM2.5所致HBE細胞的氧化損傷，且該過程可能與VDR及Nrf2/ HO-1通路的激活有關(guān)。