李 瓊，陳 燊，張海燕，吳小嫩，李道傳，陳 雯*

(中山大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，廣東 廣州 510080)

隨著我國快速的經(jīng)濟發(fā)展和城市化進程，尤其以重工業(yè)為基礎的京津冀地區(qū)為代表，經(jīng)濟發(fā)展迅速，而環(huán)境污染越來越嚴重，成為我國霧霾問題最為嚴重的地區(qū)之一。2018年我國生態(tài)環(huán)境公報指出，我國超過50%的城市是以大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)為首要污染物，因此PM2.5污染已成為我國亟待解決的公共衛(wèi)生問題。自2013 年我國74 個重點城市實施空氣質(zhì)量新標準以來，大氣細顆粒物已成為多數(shù)城市的首要空氣污染物[1]。多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是PM2.5中的主要致癌成分，其中代表性成分苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)在2014 年被國際癌癥研究中心(International Agency For Research On Cancer，IARC)定義為I 類致癌物。大氣中的PAHs 主要附著在PM2.5上，盡管它占PM2.5的質(zhì)量分數(shù)低于0.1%，但是它卻是PM2.5的主要有害成分之一。它能夠引發(fā)癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病等多種有害健康效應，對人體造成較為嚴重的危害[2-3]。然而，目前缺乏對于PM2.5及其復雜毒性組分的風險評估手段，不能快速對于復雜復合物進行有效的健康風險評價。

以往的化學物毒性評價主要基于傳統(tǒng)動物實驗進行毒性測試，主要通過動物實驗結(jié)果外推至人，具有耗時耗力，費用高昂等缺點，無法滿足現(xiàn)在對化學物毒性評價快速，高效的需求。隨著系統(tǒng)毒理學的發(fā)展，利用毒性通路進行風險評估成為評價復雜混合物風險的有效手段之一。 美國環(huán)境保護署(Environmental Protection Agency，EPA)在21世紀毒理學試驗(toxicology testing in the 21stcentury，Tox21)計劃中發(fā)展了高通量篩選(high-throughput screening，HTS)體外試驗，用于預測化學品和化學品混合物的潛在毒性。采用Tox21 毒性數(shù)據(jù)庫(Tox21 10K library)中體外HTS，可以對藥物或者環(huán)境污染物的進行毒性評估[4]。 美 國EPA 的 毒 性 預 測(toxicity forecaster，ToxCast)項目已經(jīng)基于單一化合物體外HTS，建立了一系列根據(jù)毒性通路進行風險評估的預測模型[5-6]。但是尚沒有基于毒性通路對PM2.5中PAHs 進行風險評估的預測模型。

2018年中國生態(tài)環(huán)境公報顯示，我國環(huán)境空氣質(zhì)量較差的20個城市主要集中在京津冀地區(qū)，其中石家莊排在倒數(shù)第3 位。因此，本研究選取河北醫(yī)科大學作為采樣地點，采集冬季供暖期PM2.5樣品，檢測PAHs的含量，分析PAHs污染特征，利用多路徑粒子劑量模型(multiple-path particle dosimetry model，MPPD)獲得PAHs 單體在肺部的沉積量，根據(jù)HTS 計算各PAHs單體激活各通路的單位強度，結(jié)合PAHs在肺泡的沉積量和PAHs 激活通路的強度，對PM2.5中的PAHs 引起生物毒性通路激活進行風險評估，為石家莊市大氣細顆粒物污染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

實驗主要儀器有：高流量采樣儀(美國賽默飛公司)；Agilent 5890 氣相色譜和Agilent 5973 質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?？粕齼x器有限公司)；SXT-06索氏抽提器(上海索域試驗設備有限公司)。

無水硫酸鈉和氧化鋁，實驗前在350 ℃的馬沸爐中烘烤6 h，冷卻平衡過夜備用。二氯甲烷、正己烷和乙腈均是色譜純級，購買于美國Sigma-Aldrich 公司；色譜柱是HP-5MS，購買于美國安捷倫公司。層析硅膠，200-300 目，購買于南京化學試劑股份有限公司；16 種PAHs 混合標準液，購買于美國Chemservice公司。

1.2 樣本采集

本研究選擇的采樣地點是河北省石家莊市，采樣地點設置在石家莊市中心的河北醫(yī)科大學，采樣點距離地面10 m 高的建筑物上，周圍無明顯的工業(yè)源，遠離污染源和交通主干道，沒有人為活動的干擾，較能代表石家莊市PM2.5的污染狀況。采樣時間選擇2017年石家莊冬季供暖期，因為在供暖期該市經(jīng)常出現(xiàn)霧霾天氣。利用Teflon 濾膜進行顆粒物樣本采集，采樣流量是1.05 L/min，采集時間24 h/d，累計3個月。濾膜在采樣前后均需要放在干燥器中平衡過夜，采樣后的濾膜避光低溫保存。本研究主要檢測美國EPA列出的16種優(yōu)控PAHs。

1.3 顆粒物成分解析方法

1.3.1 PAHs 檢測采樣后的Teflon 濾膜，在干燥器平衡24 h 后，每張剪取1/4，剪碎后用索氏抽提法，利用二氯甲烷∶正己烷(2∶1)進行有機組分的萃取，萃取時長72 h。再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮樣本，再加正己烷，容量瓶定容50 mL，量取1 mL，通過硅膠固相萃取柱，凈化，利用二氯甲烷∶正己烷(1∶1)洗脫，氮吹，濃縮樣本，轉(zhuǎn)移到2 mL 進樣瓶中，定容到300 μL，再進行儀器分析。

采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行分析檢測，離子源為EI，色譜柱為HP-5MS。以高純氦氣為載體，流速為1 mL/min。程序性升溫：初溫60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 速度升溫直到180 ℃，維持2 min 后，以10 ℃/min升溫到220 ℃，保持10 min，接著以0.8 ℃的速度升溫到達230 ℃，維持8 min，最后以22 ℃的速度升溫到280 ℃，保持8 min，不分流進樣，使得進樣口溫度為290 ℃。質(zhì)譜條件為EI，離子源溫度是230 ℃，四級桿溫度是150 ℃，用全掃描模式定性，用SIM進行定量分析。

1.3.2 B[a]P 的毒性當量濃度PAHs 中B[a]P 的毒性強，在估算其他PAHs 的生理毒性時，通常用毒性當量因子(toxicity equivalency factor，TEF)將其他PAHs濃度換算為等量的B[a]P 濃度(benzo[a]pyrene equivalents)。總量記為毒性當量(toxic equivalent quantity，TEQ)即TEQPAHS，按公式1計算：

i是指某一PAHs單體。

1.4 毒性通路數(shù)據(jù)獲取

從公共數(shù)據(jù)庫PubChem 上的Tox21 10k 文庫中下載。主要選擇常見的PAHs 激活的信號通路：芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)信 號 通 路(ID：743085)，核因子E2 相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)信 號 通 路(ID：743202)，p53(ID：651631)和 核 因 子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路(ID：1159509)，并根據(jù)所獲得的數(shù)據(jù)，利用Hill’s方程，重新計算16種EPA優(yōu)先控制的PAHs 激活各個信號通路的半數(shù)有效濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)以及各單體等效于B[a]P 效應的相對當量因子(relative effect potency，REP)。

1.5 風險評估

1.5.1 肺部劑量換算模型MPPD 是可以根據(jù)顆粒物濃度換算人體肺泡沉積量的模型。利用MPPD 模型將PAHs 單體日均濃度與成年人呼吸頻率、肺泡表面積、PM2.5沉降系數(shù)，單位面積和體積結(jié)合，按公式2計算PAHs單體在成人的肺泡沉積量：

式中各參數(shù)數(shù)值如表1所示。

1.5.2 生物分析等效濃度計算REP 可以將PAHs 單體換算為等效激活毒性通路的B[a]P濃度。可以根據(jù)B[a]P 的EC50與各單體的EC50比值獲得，如公式3 所示。生 物 分 析 等 效 濃 度 (bioanalytical equivalent concentration，BEQ)是用于評估混合物效應的經(jīng)典模型，它是基于混合物的效應是各單體效應累加的理論假設的預測模型。因此PAHs 的BEQ 計算如公式4 所示，利用檢測的PAHs 單體濃度與REP 的乘積，累加，可以獲得PAHs在某一毒性通路的B[a]P等效濃度。

1.5.3 體外毒作用起始點計算毒性通路激活10%有效濃度(concentration for 10% of maximal effect，EC10)定義為體外毒作用起始點(point of departure，POD)，是PAHs 對毒性通路激活的強度指標[7]。根據(jù)公式5 算出PAHs的EC10。

1.5.4 通路活性暴露比值計算考慮PAHs 單體在成人肺泡沉積量和PAHs 對通路激活的強度，利用EC10和BEQ 計算出每個毒性通路的通路活性暴露比值(activity-to-exposure ratio，AER)，比值越大，說明該通路被激活的風險越高。如公式6所示。

表1 用于計算PAHs單體肺泡沉積量的成人生理參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 顆粒物中PAHs濃度

將2017年石家莊市供暖期大氣PM2.5采集的濾膜進行PAHs 檢測，結(jié)果如表2 所示。我們發(fā)現(xiàn)16 種EPA優(yōu)控的PAHs 中僅萘沒有檢出，其余15 種均被檢出。根據(jù)TEF 計算所得到的等量B[a]P 濃度達到了17.74 ng/m3。B[a]P的濃度為9.13 ng/m3，是我國《GB 3095-2012 環(huán)境空氣質(zhì)量標準》中2.5 ng/m3的3.65 倍。另外日均濃度排名前3 的分別是苯并[b]熒蒽、熒蒽和芘，相對應的濃度分別為22.88、17.86及14.31 ng/m3。

2.2 毒性通路中各單體的EC50和REP

從PubChem 中分別獲取AhR，ARE，p53 和NFκB 的HTS，并根據(jù)公式獲得這16 種PAHs 單體的EC50和REP，結(jié)果如表3 所示。EC50值越大表明該單體對信號通路的激活的能力越弱。單體REP的數(shù)值越大說明其對通路激活的能力越強，在同等的濃度條件下，該單體更容易引起通路激活。

表2 2017年石家莊供暖期大氣顆粒物中PAHs含量

2.3 PAHs對4個毒性通路激活強度的風險評估

根據(jù)MPPD模型分別算出各個PAHs單體的肺泡沉積量，結(jié)果如表4 所示。排名前3 的分別是苯并[b]熒蒽、熒蒽和芘，對應的沉積量分別是37.9，36.92 和29.580 nmol/L，另外B[a]P 在肺泡沉積量達到了15.11 nmol/L。利用公式3和公式6分別算出各個毒性通路的BEQ 和AER，進行風險評估預測。結(jié)果如表5 所示。各通路BEQ 排序為NF-κB＞Nrf2＞AhR＞p53，對應的數(shù)值分別為7.34、3.20、0.22 和0.09。而AER 計算結(jié)果提示，吸入石家莊該冬季的PAHs，更容易被激活的通路是NF-κB，其次是AhR，最后是Nrf2 和p53 通路，其中相對應的AER 值分別為1.97、1.71、0.58 和0.28。

表3 PAHs在AhR，p53，Nrf2，NF-κB信號通路的EC50和REP值

3 討 論

PAHs 的復雜混合物存在于大氣顆粒物當中，盡管它占PM 的質(zhì)量分數(shù)不足0.1%，但是它對機體有著很嚴重的危害。PAHs 具有致突變性及致癌性，吸入暴露時與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。石家莊冬季供暖較多使用的還是燃煤供暖，這就導致了大氣中PM2.5附著的PAHs濃度會比較高。因此本研究基于Tox21毒性檢測數(shù)據(jù)庫中通路活性數(shù)據(jù)，結(jié)合2017年石家莊供暖期PM2.5中PAHs 濃度，評估PM2.5引起毒性通路激活的風險，是針對混合物暴露風險評估的預測模型。

PAHs 的毒性效應主要包括致癌性、免疫抑制性及炎癥反應等[9-10]。大多數(shù)研究認為引起這些效應的主要是AhR 激活引起。芳烴受體是一種配體激活受體，能夠與外源化學物相互作用進而上調(diào)外源化合物代謝酶，比如細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)，尤其是CYP1A1[11]。PAHs 通過激活CYP 家族代謝酶，產(chǎn)生致癌性的代謝產(chǎn)物，導致DNA加合物生成及活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平提高，而這是PAHs 致癌效應的主要機制之一[12]。體內(nèi)DNA 加合物生成提示體內(nèi)遺傳損傷增加，而當體內(nèi)出現(xiàn)遺傳損傷時，p53 作為抑癌基因，它在細胞內(nèi)的表達上調(diào)，同時參與DNA損傷修復過程。因此p53活性增加不僅表明DNA損傷增加，DNA修復能力也增加[13-14]。PAHs暴露后，隨著ROS 生成增加以及伴隨的氧化應激效應，Nrf2 信號通路會被激活，同時引起抗氧化物酶的表達，避免細胞氧化損傷。雖然Nrf2信號通路是上調(diào)體內(nèi)抗氧化機制，是適應性反應，但同時Nrf2通路的激活也是ROS產(chǎn)生的一個標志[15]。由于NF-κB信號通路在炎性因子、趨化因子分泌過程中的重要作用，被認為是重要的炎性通路。PM 暴露導致的多種損傷效應均與炎癥反應相關[16]。因此這些信號通路的激活會觸發(fā)PAHs 導致的健康效應，引起不良健康結(jié)局。因此本研究在進行HTS時，選擇了AhR、p53、Nrf2和NFκB這4個相關通路進行闡述。

表4 PAHs各單體在成人肺泡的沉積量

表5 各個信號通路的BEQ和風險評估估計值AER

風險評估的結(jié)果提示，在同等劑量的PAHs 暴露下，毒性通路的被激活的可能性從高到低分別是NFκB、AhR、Nrf2、p53。AER 不僅考慮了PAHs 單體的濃度，同時也考慮了其本身對這些通路激活的能力，更適合PAHs 引起通路激活的風險評估。根據(jù)我們的結(jié)果顯示，NF-κB是被激活可能性最高的通路，說明機體PM2.5暴露之后，很有可能是通過激活炎癥通路，進而引起后續(xù)的一系列損傷效應。這與以往研究認為炎癥反應是PM2.5引起機體損傷的主要機制之一是一致的[17]。AhR通路激活與PAHs的致癌作用密切相關。當AhR 通路被激活，不僅使PAHs 代謝產(chǎn)生致癌性代謝產(chǎn)物，同時也會促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[12]。氧化應激是PM2.5引起機體損傷比較公認的機制之一[18]，在本次研究中，Nrf2 通路被激活的風險評估較NF-κB 和AhR弱，但是它仍有被激活的可能性，因為ROS的產(chǎn)生是癌癥轉(zhuǎn)移的重要機制之一，一般當AhR激活的同時會伴隨著Nrf2 通路的擾動[19]。而p53 通路的風險預測表明它被激活的可能性很低，這與我們認為的PM2.5引起機體癌癥會增加機體的遺傳損傷相違背，這很有可能是因為石家莊PM2.5中激活p53 通路的起主要作用的PAHs 單體濃度偏低造成。綜上，說明吸入暴露于石家莊的PM2.5中附著的PAHs，很有可能是通過激活NF-κB和AhR通路，進而引起機體的進一步損傷。雖然AhR和NF-κB激活是非常早期的事件，但對不良結(jié)局而言也是的重要事件。如果我們能在早期避免這些通路的激活，就可以在一定程度上降低不良結(jié)局發(fā)生的概率。

風險評估是基于數(shù)據(jù)做出科學推斷的過程，在這個過程中會存在一定的不確定性。我們在選擇MPPD模型進行推算PAH在人體的肺泡沉積量時，沒有考慮PAHs的代謝活化，可能會低估PAHs的毒性風險。選擇BEQ模型進行PAHs混合毒性估計，如果PAHs單體之間存在拮抗作用，會過高估計PAHs 的毒效應?？偟膩碚f，這個方法在利用體外HTS和混合物暴露模型的毒性通路風險預測提供的橋梁，在未來利用該方法進行風險評估的時候，應該努力減少PAHs 單體與PM2.5之間相互作用的不確定性。持續(xù)改進用于預測體內(nèi)不良結(jié)局的體外實驗有利于提高整體預測的準確性。