舒智雄，吳傳城，吳曉麗，劉寶英*

(福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 福州350122)

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，居消化系統(tǒng)腫瘤的首位[1]，是我國農(nóng)村地區(qū)上消化道腫瘤死亡首要原因[2]，福建省仙游縣更是我國惡性腫瘤尤其是胃癌的高發(fā)區(qū)[3]。大量研究表明自噬功能紊亂會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、影響腫瘤進(jìn)展及預(yù)后[4]，近年來細(xì)胞自噬與胃癌的關(guān)系引起廣泛關(guān)注[5]。自噬的激活涉及眾多信號通路，其中磷脂酰肌醇3-激酶、絲蘇氨酸激酶和雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase/mechanistic target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)等信號通路在自噬體的形成和成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[6]，抑制其信號傳導(dǎo)可使自噬水平提高進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。PI3K/Akt/mTOR 通路上基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的存在可能導(dǎo)致其信號傳遞受阻，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]，但目前尚未見系統(tǒng)性分析該通路上與自噬相關(guān)的基因單核苷酸多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)性的研究報(bào)道。因此，本研究采用SNP芯片聯(lián)合生物信息學(xué)篩檢仙游縣胃癌患者血液中與對照人群間差異的PI3K/Akt/mTOR 通路上相關(guān)基因SNPs，采用病例-對照研究分析篩選出來的SNPs與胃癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用1∶1 配對的病例-對照研究，胃癌病例來源于福建省仙游縣醫(yī)院的胃癌新發(fā)病例。大樣本納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)手術(shù)或內(nèi)窺鏡取得組織標(biāo)本，經(jīng)病理確診的新發(fā)病例；確診日期為2013 年4 月—2017 年3 月；在仙游本地居住10年以上。芯片組納入標(biāo)準(zhǔn)是在此基礎(chǔ)上選擇男性，年齡50～70 歲，經(jīng)病理確診為胃腺癌的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為胃部炎癥、良性病變及病情危重或不能清晰回答問題者及腫瘤繼發(fā)病例和復(fù)發(fā)病例。

健康對照納入標(biāo)準(zhǔn)：按性別、年齡、地區(qū)與病例進(jìn)行配對，其中芯片健康對照選擇年齡±3歲與病例進(jìn)行配對，大樣本健康對照選擇年齡±5歲與病例進(jìn)行配對。選在仙游本地居住10年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)為：胃癌或慢性萎縮性胃炎的直系家屬。

以上標(biāo)本均要求資料和血樣完整，最后SNP芯片檢測階段我們納入病例和對照各96例，均為男性，年齡分布在52～71 歲。其中病例組平均年齡(63.8±4.6)歲，對照組平均年齡(63.8±4.7)歲。

在驗(yàn)證階段納入確診胃癌病例622 例，正常對照622 例，其中男性466 對，女性156 對。病例組由312例賁門癌患者和310 例非賁門癌患者組成。病例組年齡分布在39～89 歲，平均年齡為(67.3±9.7)歲；對照組年齡分布在41～87 歲，平均年齡為(67.2±9.7)歲。經(jīng)均衡性檢驗(yàn)，病例組與對照組在年齡、性別、職業(yè)等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。文化程度和婚姻狀況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。病例組中高中及以上的文化程度比例低于對照組，已婚的婚姻狀況比例高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

1.2 資料收集

采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的調(diào)查表，進(jìn)行面對面的訪談式調(diào)查，內(nèi)容包括研究對象的年齡、性別、文化程度、婚姻狀況、職業(yè)史等相關(guān)因素，病例的病史資料經(jīng)患者本人及醫(yī)院同意后通過摘錄電子病例獲得。同時(shí)采集病例及對照人群的空腹外周靜脈血5 mL，抽取的血樣置于EDTA抗凝管，3 000 r/min離心10 min后，分裝成血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞，置-80 ℃低溫冰箱保存。本研究涉及的調(diào)查數(shù)據(jù)及人體數(shù)據(jù)，均已通過福建醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的審查，符合醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)規(guī)定和要求。

1.3 基因分型原理與位點(diǎn)的篩選

1.3.1 芯片基因分型原理利用Affymetrix 生產(chǎn)的920K Axiom Precision Medicine Research Array 對病例和對照的外周血白細(xì)胞中的總DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性基因型檢測?；蛐酒中图夹g(shù)采用酶介導(dǎo)及單堿基測序的全自動化流程，共包含可檢測的位點(diǎn)92萬余個，其中80 多萬個SNPs 及臨床相關(guān)變異位點(diǎn)經(jīng)過GWAS 研究分析，對主要的祖先群體具有最佳的基因組覆蓋率。

1.3.2 PI3K/Akt/mTOR通路上相關(guān)基因SNPs的篩選方法通過KEGG pathway 網(wǎng)站和Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫 匯 總 PI3K/Akt/mTOR、 Autophagy 通 路(Homo sapiens) 上所有基因， 利用Ensemble 數(shù)據(jù)庫和HaploView 軟件查找二者交集基因SNPs，并與芯片中的取交集，得到芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路上與自噬有關(guān)基因SNPs，利用SPSS和Excel 軟件通過卡方檢驗(yàn)篩選出以上SNPs 在病例組和對照組中表達(dá)有差異(P＜0.05)的位點(diǎn)。同時(shí)將以上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義SNPs所在的基因通過STRING、Cytoscape 軟件做蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)分析基因編碼蛋白間的相互作用，篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。根據(jù)1000 Genomes Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)查找以上關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因SNPs 在中國南方漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)，選擇MAF 在0.15～0.4的位點(diǎn)，篩選功能預(yù)測有相應(yīng)功能的SNPs，對各多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡度(H-W 平衡)檢驗(yàn)，選取基因型頻率分布在健康對照人群中符合H-W平衡(P＞0.05)的位點(diǎn)作為候選基因位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。過程如圖1。

1.3.3 大樣本人群中基因分型原理與方法在622對病例對照人群樣本中將5個候選SNPs區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS)技術(shù)，檢測延伸產(chǎn)物分子質(zhì)量，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子大小的差異進(jìn)行SNP分型檢測。

1.4 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

對5個候選SNPs進(jìn)行基因型鑒定，使用Sequenom公司Genotyping Tools 及Mass ARRAY Assay Design軟件設(shè)計(jì)待測SNPs 的PCR 擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，序列見表1。

表1 5個SNP位點(diǎn)引物序列

1.5 質(zhì)量控制

按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制：①所有病例均經(jīng)過病理確診；②剔除DNA 總量＜0.6 μg、存在降解、有小片段RNA污染及未能檢測出基因型的樣本；③芯片分型過程中使用評估信號值分布與背景信號值的差異(Dish QC)對樣品進(jìn)行質(zhì)控，剔除Dish QC 低于0.82的樣品；④基因型的檢測和判讀采用盲法；⑤芯片檢測與MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測進(jìn)行結(jié)果一致性的比較。

本次實(shí)驗(yàn)Dish QC 均大于0.82，所有樣品都通過質(zhì)量檢測。所有樣本選擇2%的SNPs 進(jìn)行重復(fù)檢測，一致性為98.47%。前兩批采用MALDI-TOF-MS 檢測的42個SNPs與芯片中的取交集得到5個位點(diǎn)，比較這5 個位點(diǎn)分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測結(jié)果一致性好，且分型失敗率低，說明芯片分型結(jié)果可靠，如表2所示。

表2 兩種檢測方法檢測相同SNP的一致性情況

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)經(jīng)復(fù)查和核對后應(yīng)用EpiData3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入并建立數(shù)據(jù)庫。采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算對照組的各基因多態(tài)性位點(diǎn)分布是否符合H-W平衡，并進(jìn)行一般人口學(xué)資料的均衡性及兩組間的SNPs的表達(dá)是否有差異的檢驗(yàn)；采用Cox Regression 命令擬合條件Logistic模型對單個位點(diǎn)的基因型、等位基因在不同胃癌部位進(jìn)行單因素Logistic 分析，計(jì)算其比值比OR(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(confidential interval，CI)，模型中對相關(guān)混在因素進(jìn)行調(diào)整。以上分析均使用SPSS 24.0 軟件包完成。所有P 值基于雙側(cè)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路基因SNPs 篩選情況

按照上述篩選策略，各步結(jié)果如圖1。根據(jù)基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)圖顯示至少與4 個蛋白相互作用(圖2)，且Confidence Score＞0.8(表3)篩選得到IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1、RPS6KB1、PPP2CA 等 關(guān) 鍵 節(jié) 點(diǎn) 基因。與胃癌相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關(guān)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中滿足MAF 和H-W 標(biāo)準(zhǔn)的共4 個基因5 個SNPs，分別為IRS1 rs10205233、PIK3CD rs3934934、PIK3R1 rs706711、PIK3R1 rs706714、AKT1 rs35285446，詳見表4。

圖1 PI3K/Akt/mTOR通路上自噬相關(guān)基因篩選結(jié)果圖

圖2 PI3K/Akt/mTOR 通路上與胃癌相關(guān)的自噬相關(guān)基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

表3 與胃癌相關(guān)基因編碼蛋白在STRING數(shù)據(jù)庫分析相互作用的綜合得分

2.2 PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關(guān)基因SNPs 與胃癌易感性研究

本次選取的5 個SNPs 位點(diǎn)的基因型頻率分布在622例對照組中符合H-W平衡(P＞0.05)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，在調(diào)整了婚姻狀況與文化程度之后，IRS1 rs10205233 的多態(tài)性變異(C＞T)顯著降低了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[共顯性模型、顯性模型的OR(95%CI)分別為0.761(0.595，0.975)、0.764(0.601，0.973)]，進(jìn)一步分層分析，該位點(diǎn)顯性模型、隱形模型、共顯性模型以及等位基因在賁門癌和非賁門癌人群中均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。此外，尚未發(fā)現(xiàn)其余4個位點(diǎn)的共顯性模型、等位基因、顯性模型及隱性模型與胃癌、賁門癌、非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。結(jié)果詳見表5～9。

2.3 PIK3R1單體型分析

我們所研究的PIK3R1基因2個多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡分析(圖3)顯示2 位點(diǎn)間具有強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系，2位點(diǎn)共可產(chǎn)生4個單體型SNP位點(diǎn)，排列順序依次為rs706711、rs706714，結(jié)果單體型1、2、3、4 在病例和對照組的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表10。

圖3 rs706711與rs706714之間的連鎖關(guān)系分析

3 討 論

細(xì)胞自噬的生物學(xué)功能在許多類型腫瘤中已得到證實(shí)，在細(xì)胞廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起重要作用[9]。自噬的發(fā)生是一個復(fù)雜的受嚴(yán)格調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)容物的降解和再循環(huán)的動態(tài)過程，涉及多條信號通路，并由將近40個自噬相關(guān)基因編碼的自噬相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)[10]。其中PI3K/Akt/mTOR 信號作為一條經(jīng)典的抗凋亡、促存活通路，其異常激活在腫瘤形成中有著

極其重要作用[11]。Singh 等[12]通過分析PIK3CA、PTEN、mTOR 等分子作用機(jī)制，并使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑觀察胃癌細(xì)胞的惡化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中存在PI3K/Akt/mTOR 信號通路，推斷出使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑能改善胃癌細(xì)胞惡化狀態(tài)。此外，Liu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白的含量較正常細(xì)胞多，并且人體對細(xì)胞異變的防衛(wèi)組織會排斥這種蛋白，這也說明該通路蛋白是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的一個重要原因。由此可知，PI3K/Akt/mTOR 信號通路可調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖生長，是使胃部細(xì)胞惡化的重要通路。但目前尚未見系統(tǒng)性分析自噬通路相關(guān)基因與胃癌關(guān)聯(lián)性的研究，因此我們采用SNP 芯片較系統(tǒng)地研究PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關(guān)基因SNPs 與胃癌易感性的關(guān)聯(lián)。

表5 IRS1基因rs10205233位點(diǎn)與胃癌易感性的Cox回歸分析

表8 PIK3R1基因rs706714位點(diǎn)與胃癌易感性的Cox回歸分析

表9 AKT1基因rs35285446位點(diǎn)與胃癌易感性的Cox回歸分析

表10 PIK3R1不同單體型與胃癌遺傳易感性的關(guān)系

本研究首先通過KEGG 等數(shù)據(jù)庫篩選出45 個PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關(guān)基因極其445 558 個標(biāo)簽SNPs，為了更廣泛地篩選自噬通路新基因SNPs，我們將以上所有標(biāo)簽SNPs 與SNP 芯片中的位點(diǎn)做交集，發(fā)現(xiàn)有1 304 個PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關(guān)基因SNPs位于芯片中。通過卡方檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)有38 個SNPs 基因分型在胃癌病例和對照中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但這些位點(diǎn)有些在人群中的變異率很低，有些所對應(yīng)的基因并不直接受調(diào)控因素的影響，而是通過基因間相互作用，間接受調(diào)控因素變化影響。因此我們進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析篩選出PI3K/Akt/mTOR 通路上可能與胃癌有關(guān)聯(lián)的4 個自噬相關(guān)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因(IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1)及其5個SNPs，然后對其進(jìn)行大樣本驗(yàn)證，最后發(fā)現(xiàn)IRS1 rs10205233位點(diǎn)與胃癌的易感性相關(guān)，而其他位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)，并且5 個位點(diǎn)均未見文獻(xiàn)報(bào)道與腫瘤相關(guān)。

在許多癌癥研究中證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR 信號通路作為聯(lián)系胞外信號和胞內(nèi)應(yīng)答效應(yīng)的橋梁分子，可對細(xì)胞的生長、増殖、凋亡、遷移等一系列的生理功能產(chǎn)生作用，從而影響癌癥的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸。Beclin1蛋白在調(diào)節(jié)自噬起始囊泡形成的過程中起關(guān)鍵作用，Beclin1 是酵母ATG6 在哺乳動物中調(diào)節(jié)自噬的同源基因，是自噬第一階段不可或缺的基因[14]，而在Beclin1依賴的自噬中，PI3K 活性在自噬體形成中至關(guān)重要[15]。PI3K是一類脂質(zhì)激酶，其主要的生化功能是促使磷酸肌醇的3-羥基基團(tuán)磷酸化。研究認(rèn)為，通過酪氨酸激酶受體、細(xì)胞黏附分子、G 蛋白偶聯(lián)受體等的活化，PI3K 可以催化磷脂肌醇(PI)產(chǎn)生PIP3、PIP4 和PIP5。PIP3 結(jié)合并激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB 或Akt)和PDK-1，從而使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化，進(jìn)而激活一系列下游信號通路，抑制自噬的發(fā)生[16]。mTOR 信號作為調(diào)控自噬的一條經(jīng)典通路，在自噬體的形成和成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，同時(shí)也具有聯(lián)系多種自噬調(diào)控信號通路的作用，抑制mTOR 信號可使自噬水平提高進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。mTOR 蛋白是一種絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，而PI3K/Akt 具有Ser/Thr 激酶的活性，是mTOR 的上游信號。已有大量實(shí)驗(yàn)研究證明[17-18]，PI3K/Akt/mTOR 信號通路可調(diào)控許多與細(xì)胞代謝、凋亡、增殖和分化有關(guān)的蛋白，因此該通路上相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性的改變可能會影響多種蛋白活性，影響通路的生物學(xué)功能，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[19]。

我們擴(kuò)大樣本量后的病例對照研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR 信號通路上IRS1 rs10205233 位點(diǎn)(C＞T)多態(tài)性變異降低了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而胰島素受體底物1(insulin receptor substrate，IRS1)又是PI3K/Akt/mTOR信號通路的上游信號，Lecker SH 等[20]發(fā)現(xiàn)，IRS1/PI3K/AKT1信號通路的啟動取決于IRS1的活性，當(dāng)細(xì)胞外的胰島素信號通過胰島素受體和IRS1傳遞到胞內(nèi)以后，活化的IRS1 激活PI3K，再使其下游的信號分子AKT1 磷酸化，進(jìn)而將信號傳遞到mTOR 通路。多項(xiàng)研究表明IRS1 單核苷酸多態(tài)性與腫瘤有關(guān)[21-22]，如Jung 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)IRS1 rs1801123、IRS1 rs1801278與年齡等因素的聯(lián)合作用顯著增加了患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，我們推測IRS1 rs10205233 位點(diǎn)突變后，使IRS1 轉(zhuǎn)錄翻譯受阻，無法將信號傳遞給PI3K/Akt，進(jìn)而抑制mTOR的激活，引起細(xì)胞周期G1期的延緩或阻滯，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[24]，并提高自噬水平將癌細(xì)胞吞噬降解，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。

rs10205233 位點(diǎn)可能是新的胃癌患者的遺傳易感標(biāo)志物，與福建省胃癌高發(fā)區(qū)仙游縣的胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。胃癌的發(fā)生發(fā)展受到多通路、復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控，節(jié)點(diǎn)基因交織在一起，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)著自噬水平，基因突變?nèi)菀资蛊鋯适ψ允傻恼{(diào)控從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。本研究從信號通路入手，通過Affymeytrix Axiom 芯片技術(shù)與生物信息學(xué)方法，更科學(xué)、有效地篩選出符合要求的基因位點(diǎn)，為胃癌的分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料，為篩查胃癌易感人群和胃癌早期診斷提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但同時(shí)也需要更多相關(guān)的功能性研究來闡明所發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)的生物學(xué)致病機(jī)理以及探索更多未知信號通路，繪制全面的胃癌發(fā)生發(fā)展的信號通路圖，更深入地了解自噬相關(guān)基因變異在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。