李 佩 陳 見 余登航 李 清 王貴英 魏輝杰孫仁利 王守榮 孫艷紅

(1. 武漢市農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所, 武漢 430207; 2. 武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院, 武漢 430023)

黑尾近紅鲌(Ancherythroculter nigrocaudaYih et Wu), 又名黑尾鲌、高尖等, 隸屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、近紅鲌屬, 是我國長江上游特有魚類, 自然分布于四川、湖北等長江上游干支流, 具有較高經(jīng)濟價值, 隨著生存環(huán)境變化和酷捕濫漁, 黑尾近紅鲌自然資源日趨減少, 且小型化嚴重, 其種質(zhì)資源趨于退化[1—3]。武漢市農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所自2002年起開展黑尾近紅鲌的生物學、苗種繁育和池塘養(yǎng)殖技術研究并進行推廣養(yǎng)殖, 取得了一系列研究成果[4—7]。

魚類苗種的氧氣袋運輸方式具有用水量少、成活率高等優(yōu)點, 目前黑尾近紅鲌苗種的長短途運輸多采用此種方法。但在運輸過程中, 合理的運輸密度是保持良好的水質(zhì)條件、降低魚類應激水平和提高存活率的重要因素[8—10]。皮質(zhì)醇的變化可以作為魚類應激狀態(tài)下的重要指標, 魚類在應激狀態(tài)下會導致皮質(zhì)醇含量顯著上升, 而乳酸和糖元的含量也會隨應激程度的不同而呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化, 已被廣泛用作研究分析機體應激反應程度的重要指標[11—15]。

本實驗旨在研究運輸過程中, 不同運輸密度及運輸時間對水體的氨氮、溶氧、pH的影響, 以及黑尾近紅鲌全魚皮質(zhì)醇、乳酸和糖元的變化情況, 以期獲得合理的苗種運輸密度, 為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用黑尾近紅鲌為武漢市農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所人工培育獲得的仔稚魚, 實驗前轉至水泥池中人工馴養(yǎng)7d, 實驗前1d停食并拉網(wǎng)鍛煉。選取規(guī)格相近的仔稚魚作為實驗對象, 平均體長為(27.08±3.09) mm、平均體質(zhì)量為(0.11±0.04) g。實驗用水為實驗魚馴養(yǎng)所用池塘水, 水溫(27.97±0.24)℃,pH(7.66±0.03), DO(6.49±0.40) mg/L, 總氨氮濃度(0.36±0.12) mg/L。運輸用氧氣袋為25 cm×50 cm聚乙烯尼龍袋。

1.2 實驗設計

采用雙層聚乙烯尼龍袋充氧密封法運輸[16], 每袋放入占尼龍袋有效容積三分之一的池塘水(約1.5 L),放入魚后充純氧至尼龍袋膨脹且平放后不變形為度, 并用橡皮筋捆扎后放入泡沫盒, 采用車輛不間斷運輸10h。采用3×5雙因素實驗, 運輸密度為20、40和80 g/L, 運輸時間為2h、4h、6h、8h和10h。共15個處理組, 每個處理組3個重復。

1.3 樣品采集與分析

運輸開始前, 即在0時隨機選取黑尾近紅鲌10尾作為初樣品。在2h、4h、6h、8h和10h時, 取相應處理組, 測定水質(zhì)指標并采集樣品魚。在打開氧氣袋時, 立即采用HACH HQ40d便攜式水質(zhì)分析儀測定水體水溫、DO及pH, 并保存500 mL水樣用于測定總氨氮。各處理組均隨機選取10尾魚并迅速放入液氮保存, 用于測定全魚皮質(zhì)醇、乳酸及糖元含量。

檢測樣品魚時在冰浴條件下加10倍于樣品量的磷酸緩沖液(PBS)后用勻漿器將樣本勻漿充分,離心5min(5000 r/min)收集上清待測。全魚組織皮質(zhì)醇含量采用魚類皮質(zhì)醇ELISA 試劑盒(CUSABIO公司)測定、乳酸及糖元含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。氨氮采用納氏試劑分光光度法進行測定[17]。

測定各處理組魚的體長和體重(n=30), 并將每組取樣剩余的魚轉入獨立網(wǎng)箱(1 m3)中觀察24h, 記錄死亡數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)表示,經(jīng)Excel2010處理后, 以運輸密度和運輸時間作為自變量, 采用SPSS19.0軟件進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA), 同時固定其中一個因素的水平, 做另外一個因素的單因素方差分析, Duncan氏法比較差異顯著性, 顯著水平P＜0.05。

2 結果

2.1 運輸后各處理組黑尾近紅鲌的存活率

密度和時間雙因素對運輸后黑尾近紅鲌仔稚魚的存活率具有顯著交互作用(P＜0.05, 表 1)。在運輸4h后, 20 g/L密度組的存活率顯著高于40和80 g/L密度組, 但各密度組的存活率均保持在99.00%以上(圖 1)。

表 1 雙因素方差分析運輸密度和運輸時間對黑尾近紅鲌皮質(zhì)醇、乳酸、糖元含量及氧氣袋內(nèi)水質(zhì)的影響Tab. 1 Summary of two-way ANOVA results of effects of density and time on cortisol, lactate and glycogen content and water quality

2.2 運輸后各處理組水體總氨氮濃度、DO濃度及pH

密度和時間雙因素對運輸后氧氣袋水體的總氨氮濃度具有顯著交互作用(P＜0.05, 表 1)。隨著運輸時間的延長, 各處理組水體總氨氮濃度均不斷升高, 且20 g/L密度組的總氨氮濃度顯著低于40和80 g/L密度組(圖 2A)。

密度和時間雙因素對運輸后氧氣袋水體的DO濃度具有顯著交互作用(P＜0.05, 表 1)。20和40 g/L密度組的水體DO在不同運輸時間后均維持在14 mg/L以上的較高水平, 80 g/L密度組的水體DO在不同運輸時間均處于5 mg/L以下的較低水平(圖 2B)。

密度和時間雙因素對運輸后氧氣袋水體的pH無顯著交互作用(P＞0.05, 表 1)。隨著運輸時間的延長, 各處理組水體pH均不斷降低, 且20 g/L密度組的pH顯著高于于40和80 g/L密度組(P＜0.05,圖 2C)。

2.3 運輸后各處理組黑尾近紅鲌全魚皮質(zhì)醇、乳酸及糖元含量

密度和時間雙因素對運輸后黑尾近紅鲌的全魚皮質(zhì)醇含量具有顯著交互作用(P＜0.05, 表 1)。在運輸過程中, 不同密度處理組的全魚皮質(zhì)醇含量均顯著升高, 在6h后出現(xiàn)降低, 但仍遠高于運輸前的水平(P＜0.05)。且在運輸2h、4h、6h后, 40和80 g/L密度組的皮質(zhì)醇含量顯著高于20 g/L密度組(P＜0.05,圖 3A)。

密度和時間雙因素對運輸后黑尾近紅鲌的全魚乳酸含量無顯著交互作用(P＞0.05), 且影響運輸過程中魚體乳酸含量的主要因素為運輸時間(表 1)。在運輸過程中, 不同密度處理組的全魚乳酸含量均顯著升高, 顯著高于運輸前的含量(P＜0.05), 但在同一運輸時間的不同密度組之間無顯著差異(P＞0.05,圖 3B)。

密度和時間雙因素對運輸后黑尾近紅鲌的全魚糖元含量無顯著交互作用(P＞0.05), 且影響運輸過程中魚體糖元含量的主要因素為運輸密度(表 1)。在運輸2h后, 不同密度處理組的全魚糖元含量較運輸前均顯著降低(P＜0.05), 之后均維持在穩(wěn)定的水平。運輸2h后不同密度組的全魚糖元含量具有顯著差異(P＜0.05), 但在4—10h運輸時間下的不同密度組之間無顯著差異(P＞0.05, 圖 3C)。

圖 2 運輸后各處理組水體總氨氮、溶解氧及pHFig. 2 Total ammonia nitrogen, DO and pH of water after transportation

3 討論

3.1 運輸時間和密度對氧氣袋內(nèi)水質(zhì)的影響

采用塑料袋充氧方式運輸魚苗, 袋內(nèi)水體的水質(zhì)狀況是影響運輸后魚苗存活率及健康程度的重要因素之一, 主要包括氨氮、溶氧和pH等[18—20]。本研究發(fā)現(xiàn)在采用氧氣袋運輸黑尾近紅鲌仔稚魚時, 魚體的新陳代謝會排出大量非離子氨, 從而導致袋內(nèi)水體的總氨氮濃度急劇升高, 高密度運輸10h后甚至可以達到(38.50±0.93) mg/L, 且水體氨氮濃度的差異主要由運輸密度的不同所導致。對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[21]、翹嘴鲌(Culter alburnus)[8]、大黃魚(Larimichthys crocea)[9]、銀鯰(Rhamdia quelen)[22]的模擬運輸研究實驗也均發(fā)現(xiàn)水體總氨氮濃度隨著運輸時間和密度的增加顯著上升。研究表明, 在相似水溫下總氨氮對雜交鲌“先鋒1號”[Erythroculter ilishaeformis(♀)×Ancherythroculter nigrocauda(♂) hybridF1]仔稚魚的24hLC50為54.84 mg/L[23], 對不同溶氧條件下黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)幼魚的24hLC50為(112.25—295.58) mg/L[24]。在本實驗中, 10h運輸后水體總氨氮濃度為(38.50±0.93) mg/L, 理論上應處于黑尾近紅鲌可耐受范圍內(nèi)。

在不同運輸時間后, 袋內(nèi)水體溶氧濃度表現(xiàn)出極大的差異, 中低密度實驗組顯著高于高密度組。在運輸過程中水體振蕩, 將袋內(nèi)的氧氣更多地溶解到水體中, 造成中低密度下水體溶氧濃度保持在14.42—20.93 mg/L, 但較高運輸密度下魚體的呼吸作用導致80 g/L的運輸密度組的溶氧僅能維持在2.42—2.88 mg/L。這表明在80 g/L的運輸密度下,魚體對水體溶氧的消耗速度高于袋內(nèi)氧氣溶解的速度。對翹嘴鲌的運輸實驗表明運輸脅迫會導致其的耗氧率顯著升高, 且隨密度的增加而增大[8]。相關研究表明, 不同規(guī)格黑尾近紅鲌幼魚的平均窒息點為0.40 mg/L左右, 這也是80 g/L運輸密度下黑尾近紅鲌仔稚魚沒有出現(xiàn)缺氧窒息原因[25]。

在本實驗中, 各組的水體pH均隨運輸時間顯著降低, 80 g/L組在10h后降低至7.00±0.01。相關研究表明, 在運輸脅迫下魚類代謝速率等加快, CO2等代謝產(chǎn)物也隨之增加并迅速溶于水體, 降低水體pH[26—29]。由于水體氨氮的毒性, 即分子氨的濃度與pH密切相關, 較低的pH也是黑尾近紅鲌仔稚魚能夠耐受較高的總氨氮濃度的因素之一。我國主要養(yǎng)殖魚類對水的pH變化有較大的適應能力, 適應pH為4.6—10.2, 適宜的pH為7—9, 若長期生活在pH 6.0和10.0的水中, 生長則會受到抑制[30]。在pH低于6.5的時候, 會對仔魚的生長造成不利影響[31]。

圖 3 運輸后各處理組全魚皮質(zhì)醇、乳酸及糖元含量Fig. 3 Concentrations of cortisol, lactate and glycogen of Ancherythroculter nigrocauda after transportation

3.2 運輸時間和密度對黑尾近紅鲌全魚皮質(zhì)醇、乳酸及糖元含量的影響

皮質(zhì)醇是魚體在受到外界環(huán)境刺激后所分泌的一種重要應激激素, 皮質(zhì)醇的變化可以有效地反映其應激程度[32], 相關研究表明[13,33,34], 運輸脅迫會導致魚類的皮質(zhì)醇含量顯著升高。本實驗表明不同運輸密度下黑尾近紅鲌仔稚魚的全魚皮質(zhì)醇含量在運輸中均不斷升高, 并在6h時達到最高。在運輸?shù)暮笃? 可能由于魚體對環(huán)境的適應, 皮質(zhì)醇含量出現(xiàn)了降低, 但仍顯著高于運輸前的水平。據(jù)認為較高的密度, 即擁擠脅迫也會導致魚類產(chǎn)生應激反應, 造成皮質(zhì)醇激素含量的升高, 急性擁擠脅迫導致鯉的血液皮質(zhì)醇濃度由對照組的18.6 ng/mL升高至302.3 ng/mL; 實驗前草魚血漿平均皮質(zhì)醇濃度為6.23 ng/mL, 而在受到擁擠脅迫后最高達到超過100 ng/mL[35,36]。本實驗同樣顯示80 g/L運輸密度下全魚皮質(zhì)醇的含量顯著高于較低的運輸密度。同時運輸時受到的應激也會導致魚類體內(nèi)皮質(zhì)醇含量的升高, 相關研究發(fā)現(xiàn)在運輸4h的時候不同種類魚類的血漿皮質(zhì)醇濃度均增加0.5倍至4.0倍[37]。對斑馬魚(Danio rerio)的運輸實驗發(fā)現(xiàn)在運輸開始后全魚皮質(zhì)醇的含量迅速增加了10余倍[38]。在本實驗中, 不同運輸密度下黑尾近紅鲌的全魚皮質(zhì)醇含量在運輸6h時較運輸前(44.50±3.11) ng/mL增加了1.12倍至1.67倍。

魚體的乳酸主要是由肌肉在供氧不足的情況下,通過糖酵解產(chǎn)生。水體溶氧含量低、魚體劇烈運動等都可導致魚體乳酸含量升高[39]。對大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的研究中也發(fā)現(xiàn), 運輸脅迫會導致魚體組織中乳酸含量的升高[40]。在本實驗中, 不同運輸密度下黑尾近紅鲌的全魚乳酸含量均隨著運輸時間的延長而出現(xiàn)明顯升高, 但并不受運輸密度的影響, 這表明其乳酸含量的升高主要由運輸中的持續(xù)劇烈運動導致。相關運輸實驗表明,大黃魚運輸前全魚乳酸含量為0.57 mmol/g, 而運輸后各密度組升高至1.21—2.02 mmol/g[9]; 翹嘴鲌全魚乳酸含量從運輸前的1.50 mmol/g左右升高至運輸后的3.00 mmol/g[41]。在本實驗中, 不同運輸密度下黑尾近紅鲌的全魚乳酸含量由運輸前的1.41 mmol/g升高至至運輸10h時的2.89—3.07 mmol/g。

糖元是由葡萄糖結合而成的支鏈多糖, 是動物體內(nèi)糖的儲存形式, 機體通過對糖元的分解來維持血糖濃度的相對穩(wěn)定[35]。在本實驗中, 黑尾近紅鲌仔稚魚全魚的糖元含量除了顯著低于運輸前之外,不同運輸時間和運輸密度并未對其造成顯著影響。相關研究[36—38]表明，環(huán)境脅迫如饑餓、運輸、密度、溫度、低氧等均會導致魚體肝糖元和肌糖元的降低, 據(jù)此認為魚類在脅迫狀態(tài)下會促進糖元異生向機體供能。魚類糖元主要貯存在肝臟和肌肉組織中, 對刀鱭(Coilia nasus)的研究表明在28℃下其肝臟組織和肌肉組織中糖元含量分別為2.0和0.2 mg/g[46]; 在相同水溫下銀鯧(Pampus argenteus)肝臟和肌肉組織中糖元含量分別為1.26—2.39和0.24—0.37 mg/g[47]; 在不同運輸密度和鹽度下大黃魚幼魚全魚的糖元含量由運輸前的4.37 mg/g降低至運輸后的1.5—2.0 mg/g[9]。在本實驗中, 在不同運輸密度下黑尾近紅鲌全魚的糖元含量由運輸前的1.50 mg/g降低至運輸后的0.85—1.09 mg/g。

4 結論

運輸密度和時間對黑尾近紅鲌仔稚魚的全魚皮質(zhì)醇、存活率、水體總氨氮和溶解氧產(chǎn)生了顯著的影響, 且存在顯著交互作用。但無論是高密度組還是低密度組的平均死亡率都在1%以下, 說明了黑尾近紅鲌仔稚魚對運輸脅迫具有一定的抗逆性。采用本實驗的運輸條件, 在運輸10h的情況下,黑尾近紅鲌仔稚魚可以承受80 g/L的運輸密度所帶來的應激反應, 且不會引起運輸后仔稚魚發(fā)生大量死亡, 但80 g/L的運輸密度會導致氧氣袋內(nèi)水體水質(zhì)嚴重惡化, 溶氧極低且氨氮濃度極高, 存較大風險。綜合考慮實際操作中的運輸成本等因素, 黑尾近紅鲌仔稚魚的運輸密度以40 g/L較為安全; 但在運輸時間不超過10h或采取空運方式時, 可適當增大運輸密度以節(jié)約成本。