丁亞濤 楊 豐 王林林 施文正, 汪之和, ,

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海), 上海 201306;3. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306)

中國漁業(yè)資源豐富, 品種繁多。2017年, 中國全年水產(chǎn)品總產(chǎn)量6.45×1010kg, 同比增長1.03%[1];由此可以看出我國未來幾年水產(chǎn)總量有著持續(xù)穩(wěn)步的增長趨勢。由于中國地域遼闊, 水產(chǎn)養(yǎng)殖量大,為了滿足廣大消費(fèi)者對不同地區(qū)鮮活水產(chǎn)品的需求, 水產(chǎn)品?；钸\(yùn)輸顯得十分重要。

一種有效的高密度魚類運(yùn)輸方法可有效地減少應(yīng)激反應(yīng)和長途運(yùn)輸中的死亡率, 麻醉是一種有效的?；钸\(yùn)輸方法, 它通常能夠降低代謝率[2,3], 提高運(yùn)輸效率和減緩應(yīng)激反應(yīng)[4]。一般常用的麻醉劑包括間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)、丁香油(4-甲-2-甲氧基苯酚)、醇類、氯醛、乙醚、氯酮、巴比妥酸鹽、苯甲卡因和喹啉等。理想的麻醉劑應(yīng)該具有無毒、廉價(jià)、快速誘導(dǎo)等特點(diǎn)[5]。目前, MS-222被美國食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)為是可用的麻醉劑, 但是美國食品藥品管理局要求使用MS-222處理的魚必須經(jīng)過21d的休藥期; 丁香油被FDA認(rèn)為是安全麻醉劑[6,7], 并對大西洋鮭(Salmo salar)[8]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[9]、鱖(Sini-perca chuatsi)[10]和西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[11]幼魚等魚類的麻醉功效進(jìn)行了研究。

鳊魚又名鳊(Parabramis pekinensis)。在中國,鳊也為團(tuán)頭魴(武昌魚)和三角魴統(tǒng)稱。鳊是中國養(yǎng)殖量比較大且具有養(yǎng)殖潛力的淡水物種之一, 不僅味道鮮美, 且營養(yǎng)價(jià)值較高, 富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。然而, 關(guān)于鳊麻醉保活運(yùn)輸?shù)膱?bào)道還沒有。本研究為探索和確定丁香油在鳊麻醉保活運(yùn)輸中的最佳條件, 并在此條件下進(jìn)行模擬運(yùn)輸, 分析魚體指標(biāo)變化, 為鳊的麻醉?；钸\(yùn)輸提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

鳊源于中國上海的魚市場, 體重(495.14±28.90) g,體長(20.37±3.06) cm。禁食暫養(yǎng)24h, 溶解氧＞ 6 mg/L。丁香油購買于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司; 丁香油與乙醇按比例1∶9溶解, 配成濃度1 g/L備用。

1.2 主要儀器

5B-3N便攜式氨氮測定儀(上海連華科技有限公司)、ZC-10智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠)、UV-1800PC紫外可見分管光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、JPB-607型便攜式溶解氧測定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、車載速凍冰箱(佛山艾凱電器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

不同丁香油濃度下鳊呼吸頻率影響的測定將丁香油配制0、5、10、20、30和40 mg/L 6個(gè)濃度梯度, 將鳊放入溶液開始計(jì)時(shí), 分別記錄鳊在60s、120s、180s、240s、300s和360s時(shí)間段內(nèi)的呼吸次數(shù)。呼吸頻率以1min內(nèi)鳊鰓蓋張合次數(shù)來表達(dá)(每個(gè)平行組樣本為4尾魚)。

不同濃度的丁香油對鳊麻醉效果的研究將鳊分別放入不同濃度丁香油麻醉液之中, 觀察其行為特征和生理反應(yīng)(每個(gè)平行組樣本為4尾魚)。當(dāng)鳊被麻醉到A6階段后, 立即將其轉(zhuǎn)移入清水箱中復(fù)蘇。確定麻醉和蘇復(fù)時(shí)間及呼吸頻率。表 1和表 2為鳊麻醉和復(fù)蘇效果的標(biāo)準(zhǔn)及行為特征, 在麻醉過程中有6個(gè)階段(A1—A6), 恢復(fù)過程分為3個(gè)階段(R1—R3)。

不同濃度丁香油對鳊?；畲婊盥实挠绊戇x擇呼吸頻率一致的鳊作為試驗(yàn)對象, 在0、10、20、30和40 mg/L這五個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn), 記錄鳊的存活率(每個(gè)平行組樣本為10尾魚, 下同)。

不同水溫對鳊?；畲婊盥实挠绊懺?0 mg/L麻醉劑濃度條件下, 選擇2、7、15和20℃這四個(gè)溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn), 記錄鳊的存活率。

表 1 麻醉程度分期及魚類行為特征Tab. 1 Anesthesia effects and fish behavior characteristics

表 2 魚體復(fù)蘇過程分期及行為特征Tab. 2 Stages and characteristic behavior during fish recovery

不同魚水質(zhì)量比對鳊保活時(shí)間的影響在7℃和20 mg/L麻醉劑濃度條件下, 選擇不同魚水質(zhì)量比(2∶1、1∶1、1∶3和1∶5)進(jìn)行試驗(yàn), 記錄鳊?；顣r(shí)間。

保活條件的優(yōu)化在丁香油麻醉液濃度(0、10、20、30 和40 mg/L)、水溫(2、7、15、20℃)和魚水質(zhì)量比(2∶1、 1∶1、1∶3、 1∶5)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 確定魚水質(zhì)量比、水溫和麻醉濃度三因素3水平正交試驗(yàn)來優(yōu)化鳊的存活時(shí)間。表 3為正交測試L9(34)參數(shù)。

表 3 L9(34)正交試驗(yàn)因素及水平表Tab. 3 The table of factors and level in L9(34) orthogonal test levels

鳊?；钸^程中水體指標(biāo)的測定在最佳條件下進(jìn)行?；钤囼?yàn), 并測定水體相關(guān)指標(biāo)。在?；钸^程中的不同時(shí)間段, 用離心管分別從保活箱中取25 mL水, 用PB-607A便攜式溶解氧測定儀測定氧含量, 用5B-3N便攜式氨氮測定儀測定氨氮, 用pH計(jì)測定pH。

菌落總數(shù)的測定: 在保活過程中的不同時(shí)間段, 用離心管從?；钕渲腥? mL水, 使用國標(biāo)GB 4789.2—2016進(jìn)行測定。

鳊?；钸^程中魚體指標(biāo)的測定麻醉組和對照組分別在最佳條件下進(jìn)行保活試驗(yàn), 在?；钸^程中的不同時(shí)間段隨機(jī)采樣, 進(jìn)行指標(biāo)測定。

肌肉中乳酸和糖元的測定: 采用測試盒測定(購自南京建成生物工程研究所)。

肌肉pH測定方法: 準(zhǔn)確稱量2 g魚肉于燒杯中,加0.85%生理鹽水18 mL, 均質(zhì)后靜置0.5h, 使用pH計(jì)測定。

血清生化指標(biāo)的測定: 從魚尾靜脈采血, 血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、尿素(UARBAMIDE)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酐(CREA)采用試劑盒測定, 購自南京建成生物工程研究所。

數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel 2007和SPSS19.0軟件進(jìn)行分析, 在單因素方差分析的基礎(chǔ)上采用Duncan (D)多重比較法, 統(tǒng)計(jì)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 顯著性水平為P＜0.05; 利用Origin 8.0軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 在不同丁香油濃度中鳊呼吸頻率的變化

呼吸頻率是反映鳊麻醉程度的重要指標(biāo)之一。表 4中顯示不同濃度丁香油麻醉液中鳊呼吸頻率(鰓蓋運(yùn)動(dòng))的變化。隨著丁香油濃度的增加, 呼吸頻率逐漸下降。在0和5 mg/L濃度時(shí), 鳊呼吸頻率沒有顯著變化。在10 mg/L濃度下, 呼吸頻率有所減少, 但二者均無應(yīng)激反應(yīng), 在20和30 mg/L時(shí),呼吸頻率顯著下降, 在40 mg/L時(shí), 呼吸率在短時(shí)間內(nèi)急劇下降, 出現(xiàn)鰓蓋運(yùn)動(dòng)停止的現(xiàn)象。

2.2 不同麻醉濃度下鳊麻醉、復(fù)蘇過程的行為特征及麻醉后復(fù)蘇率

在不同濃度的丁香油麻醉溶液中, 鳊表現(xiàn)出一系列不同的行為特征(表 5和表 6)。麻醉和復(fù)蘇時(shí)間隨著丁香油濃度的不同而變化。隨著丁香油濃度的增加, 鳊進(jìn)入麻醉的時(shí)間縮短, 復(fù)蘇時(shí)間也相應(yīng)增加。丁香油濃度為0, 鳊沒有被麻醉。在5 mg/L的濃度下, 鳊最終達(dá)到了A1階段。在濃度增加到10 mg/L時(shí), 魚的麻醉程度加深, 最終將停留在A2階段。在20 mg/L的濃度下, 需要較長時(shí)間達(dá)到A6, 復(fù)蘇時(shí)間增加, 在清水中可以恢復(fù)到正常狀態(tài)。當(dāng)麻醉溶液濃度為30和40 mg/L時(shí), 大多數(shù)魚都達(dá)到了A6, 魚體蘇醒需要很長時(shí)間, 復(fù)蘇后活力較差, 復(fù)蘇率也有下降。

2.3 不同麻醉劑濃度對鳊存活率的影響

如圖 1所示, 在濃度為0和10 mg/L時(shí), ?；?6h后存活率顯著下降。麻醉濃度為20 mg/L, ?；?8h內(nèi)的存活率仍為90%; 麻醉濃度為30 mg/L, 存活率在24h后顯著降低, ?；?8h存活率下降至20%。當(dāng)麻醉濃度40 mg/L, 12h后存活率顯著下降,并且保活36h存活率降為0。由此可見, 麻醉濃度為20 mg/L?；顣r(shí)存活率較高。

2.4 不同溫度對鳊存活率的影響

如圖 2所示, 在水溫20℃時(shí)的鳊的存活率顯著下降, 在24h內(nèi)下降到30%, 并且48h后存活率為0。在15℃時(shí), 24h之后顯著下降, 48h的存活率下降到30%。在7℃時(shí), 36h后出現(xiàn)死亡, 48h的存活率為80%。然而在2℃時(shí), 12h存活率下降到50%,24h存活率為0。由此可見, 在7℃?；顣r(shí)存活率較高。

表 4 鳊在不同濃度中各個(gè)時(shí)間段呼吸頻率的變化Tab. 4 Breath frequency of bream at different times under of anesthesia of different concentrations

表 5 不同濃度丁香油對鳊麻醉影響Tab. 5 The effect of different concentrations of clove oil on the anesthetic level in bream

2.5 不同魚水質(zhì)量比對鳊?；顣r(shí)間的影響

如圖 3所示, 當(dāng)魚水質(zhì)量比從2∶1增加到1∶3時(shí),存活時(shí)間顯著增加, 且1∶1到1∶3?；顣r(shí)間增加了28h, 增幅較大。從1∶3到1∶5的增長并不顯著, 所以魚水質(zhì)量比1:3比較適宜。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明, 當(dāng)丁香油濃度為20 mg/L時(shí), 鳊存活率較高, 因此, 在正交試驗(yàn)中選擇丁香油濃度為15、20和25 mg/L。水溫在7℃和15℃時(shí),鳊存活率較高, 所以, 在正交試驗(yàn)中選擇了水溫是5℃、9℃和13℃。魚水質(zhì)量比從1∶1增加到1∶3, 鳊存活時(shí)間增幅最大, 即正交試驗(yàn)中魚水質(zhì)量比選擇1∶1、1∶2和1∶3。由表 3正交試驗(yàn)因素及水平進(jìn)行試驗(yàn), 得出正交試驗(yàn)結(jié)果見表 7。

表 6 鳊在不同丁香油濃度后的復(fù)蘇情況Tab. 6 The effect of different concentrations of clove oil on the degree of the degree of bream

圖 1 不同濃度丁香油對鳊?；畹拇婊盥视绊慒ig. 1 The variation in the survival rate of bream soaked in different concentrations of clove oil solution

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示(表 8), 影響鳊?；畹囊蛩貫? A(魚水質(zhì)量比)＞B(水溫)＞C(麻醉濃度), 麻醉?；钭罴褩l件為A3B2C1, 即魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L。

驗(yàn)證試驗(yàn)顯示, 在此條件下, 鳊50h內(nèi)存活率100%, 當(dāng)?；?4h, 存活率80%以上。而對照實(shí)驗(yàn)?；?4h, 存活率僅為53.3%。

圖 2 不同水溫對鳊存活率的影響Fig. 2 Effect of different temperatures on the survival rate of bream

圖 3 魚水質(zhì)量比對鳊?；顣r(shí)間的影響Fig. 3 The effect of the fish water quality ratio on the survival time of bream

2.7 鳊?；钸^程中水體指標(biāo)的變化

如表 9所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃,麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊?；钸\(yùn)輸過程中水質(zhì)指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示, 對照組和麻醉組水體pH在7.4—7.9; 溶解氧的含量在6.3—6.6 mg/L波動(dòng),無明顯變化; 水中氨氮的含量顯著上升, 麻醉組?；?8h氨氮濃度上升至4.03 mg/L, 但明顯低于對照組。菌落總數(shù)也有顯著增加, 麻醉組略低于對照組。氨氮濃度和微生物這二項(xiàng)指標(biāo)的增加可能是導(dǎo)致魚體死亡的主要原因。

2.8 鳊保活過程中魚體相關(guān)成分的變化

肌肉相關(guān)成分的變化如圖 4所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊?；钸\(yùn)輸過程中魚體肌肉指標(biāo)的變化。結(jié)果表明, 在保活過程中, 鳊肌肉中糖元、乳酸和pH都發(fā)生了一定程度的變化, 糖元含量明顯下降, 麻醉組保活48h后下降了35.5%, 下降趨勢低于對照組。麻醉組乳酸含量在24h內(nèi)顯著增加, 增加趨勢低于對照組, 然后略有下降。麻醉組和對照組pH均先降后升, 這與鳊在麻醉保活中肌糖元消耗產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致pH變化有關(guān)。

血清生化指標(biāo)的變化如表 10所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊保活運(yùn)輸過程中魚體血清生化指標(biāo)的變化。結(jié)果表明, 麻醉組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)活性在12h后顯著增加, 48h后AST和LDH的活性比初始值分別增加了4.3倍和1.9倍。血糖(GLU)含量逐漸增加。尿素和肌酐含量隨保活時(shí)間的增加而上升, 48h后分別增加了2.9倍和3.5倍, 以上指標(biāo)的變化均為麻醉組低于對照組。

表 7 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab. 7 Results of the L9(34) orthogonal test

表 8 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab. 8 Analysis of variance

3 討論

3.1 丁香油濃度、水溫和魚水質(zhì)量比對鳊存活率的影響

麻醉可以減少魚類運(yùn)輸過程中的一般活動(dòng)和應(yīng)激反應(yīng)。研究結(jié)果表明, 丁香油濃度對鳊保活運(yùn)輸?shù)某苫盥视忻黠@影響。隨著丁香油濃度的增加,鳊的呼吸頻率逐漸下降, 在丁香油濃度為20 mg/L時(shí), 鳊的存活率最高。丁香油濃度40 mg/L時(shí), 由于濃度過高, 會(huì)對鳊產(chǎn)生毒害而無法復(fù)蘇, 降低了其存活率。而濃度為0和10 mg/L時(shí), 由于濃度過低達(dá)不到麻醉鳊的效果, 對其存活率的提高作用較小。溫度是影響魚類生理狀況的重要因素之一, 魚類為變溫動(dòng)物, 其生理狀況受環(huán)境溫度的影響較大, 隨著溫度的升高, 魚的代謝率增加, 耗氧量增加。但在過低溫度下, 魚體本身需要提供能量來應(yīng)對外界低溫, 呼吸頻率下降, 無法滿足魚體用氧而導(dǎo)致其死亡, 鳊在在水溫7℃左右運(yùn)輸存活率較高。在水產(chǎn)品?；钸\(yùn)輸中降低魚水質(zhì)量比是需要考慮的重點(diǎn)之一; 綜合考慮保活時(shí)間和成活率等因素, 選擇魚水質(zhì)量比1∶3符合最大的經(jīng)濟(jì)效益。

表 9 ?；钸^程中水質(zhì)指標(biāo)變化Tab. 9 Changes in water quality parameters during the test

3.2 ?；钸^程中水體指標(biāo)變化對鳊存活率的影響

魚類氨氮耐受水平一般在2.0 mg/L左右, 試驗(yàn)結(jié)果顯示, 隨著保活時(shí)間的延長, 氨氮濃度逐漸增加, ?；?8h后對照組氨氮濃度是麻醉組的1.9倍, 說明麻醉能降低魚體代謝產(chǎn)生氨氮, 減緩水質(zhì)惡化, 更利于鳊的存活; 但麻醉組氨氮濃度也超出魚類氨氮耐受水平, 這也是鳊?；?8h后存活率下降的重要原因之一。這與Park等[4,12]研究尖吻鱸模擬麻醉運(yùn)輸和王利娟等[13]研究加州鱸?；畹慕Y(jié)果有類似的趨勢一致。溶解氧對魚類等水生生物的生存至關(guān)重要。當(dāng)溶解氧低于5 mg/L時(shí), 大多數(shù)魚很難存活[14], 在試驗(yàn)過程中溶氧量范圍在6.3—6.6 mg/L, 高于此推薦值。Rodrigues等[15]認(rèn)為, 對于軍曹魚(Rachycentron canadum)來說pH安全值最低是6.5, 本試驗(yàn)中pH從6.9增加到7.8, 此結(jié)果在淡水魚水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的pH 6.6—8.5[16]。菌落總數(shù)是評估水污染程度的重要指標(biāo)[17]。在漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中[16], 大腸桿菌的總數(shù)必須低于每5000個(gè)/L。隨著水中細(xì)菌總數(shù)的增加, 氧氣的消耗將會(huì)增加, 代謝廢物增多, 從而導(dǎo)致水的渾濁度增加; 在鳊?；?8h后, 細(xì)菌數(shù)增加, 水質(zhì)發(fā)黃、渾濁, 這也是影響鳊存活時(shí)間原因之一。

圖 4 保活過程肌肉中乳酸、糖元、pH的變化Fig. 4 Changes in lactic acid, glycogen, and pH in muscle during the experimental process

表 10 鳊保活過程中血清生化指標(biāo)變化Tab. 10 Changes in the serum biochemical values in bream after transportation under anesthesia

3.3 麻醉?；顚∪庀嚓P(guān)成分和血清生化指標(biāo)的影響

糖元、葡萄糖和乳酸水平在肌肉、血液和肝臟中保持一定的平衡, 魚類利用肝糖元的能力差,主要分解肌糖元[18]。鳊在?；钪屑√窃匡@著減少, 可能是因?yàn)轸~處于饑餓狀態(tài), 血液中葡萄糖無法滿足魚體的需要, 而肌肉糖元就會(huì)被分解, 這與王利娟等[19]研究加州鱸魚模擬?；畹慕Y(jié)果類似。乳酸含量先升后降, 這與糖元分解產(chǎn)生乳酸有關(guān), 并導(dǎo)致肌肉pH下降, 隨著乳酸的分解, pH又上升。LDH是一種與葡萄糖代謝有關(guān)的酶, 當(dāng)器官和組織受損時(shí), LDH釋放進(jìn)入血液, 使血清LDH水平上升。AST是肝臟中連接糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的一個(gè)重要酶, 當(dāng)組織受損時(shí)會(huì)升高, 并且它能在谷氨酸和草酰乙酸之間起到催化轉(zhuǎn)氨作用。在鳊保活中, 麻醉組血清LDH和AST在12h后顯著增加,表明隨著保活時(shí)間的延長, 對肝功能有一定程度的影響。血漿葡萄糖升高被認(rèn)為是魚類應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)之一, 當(dāng)細(xì)胞代謝功能失調(diào), 葡萄糖利用率低時(shí)會(huì)導(dǎo)致血糖水平升高。在鳊?；钤囼?yàn)中, 麻醉組血糖濃度在36h內(nèi)增加了2.6倍, 之后血糖降低, 說明隨著保活時(shí)間的延長, 魚體會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 但魚體通過自身的調(diào)節(jié)逐漸適應(yīng)環(huán)境。尿素和肌酐含量的變化可以反映腎臟功能的代謝狀況, 尿素也是維持血液滲透壓的主要成分。在腎功能不全的情況下, 血液尿素和肌酐會(huì)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 麻醉組鳊血液尿素和肌酐含量逐步上升, ?；?8h時(shí)分別增加了2.9倍和3.5倍, 說明在整個(gè)?；钸^程中腎功能受到一定程度的影響。綜合以上指標(biāo)可見,丁香油在用于鳊麻醉?；钸\(yùn)輸時(shí), 有助于延長其?；顣r(shí)間和提高成活率。