李 瑩 王 慶 魏 南 曾 悅 崔宗斌 楊宇峰

(1. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系, 廣東省高校水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心, 廣州510632; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

輪蟲(chóng)是一類(lèi)體形較小的后生假體腔動(dòng)物(50—2000 μm), 蛭態(tài)類(lèi)輪蟲(chóng)廣泛分布于各水生、半水生(苔蘚、土壤、地衣等)等生境。根據(jù)現(xiàn)被廣泛采用的分類(lèi)系統(tǒng), 輪蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)包含三個(gè)綱: 單巢綱、雙巢綱和尾盤(pán)綱[1,2]。蛭態(tài)亞綱輪蟲(chóng)具有兩個(gè)卵巢,終身行孤雌生殖, 在環(huán)境處于缺水或缺氧等惡劣情況時(shí), 脫水可以進(jìn)入隱生狀態(tài)(Anhydrobiosis), 待環(huán)境好轉(zhuǎn), 重新恢復(fù)到正常的生活狀態(tài)[3]。蛭態(tài)類(lèi)輪蟲(chóng)是現(xiàn)今具有基因和形態(tài)特征的最古老且通過(guò)無(wú)性生殖進(jìn)化的類(lèi)群[4,5]。根據(jù)以上蛭態(tài)輪蟲(chóng)的特征,研究蛭態(tài)輪蟲(chóng), 對(duì)揭開(kāi)生物進(jìn)化、物種分化以及隱生等機(jī)制等具有重要的推動(dòng)作用。

敖突輪屬(Otostephanos)作為宿輪科三屬之一[6],具有宿輪科輪蟲(chóng)體內(nèi)特有的食物泡(Food pellet), 輪盤(pán)伸展時(shí)帶有的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)為該屬輪蟲(chóng)最重要的分類(lèi)學(xué)依據(jù)[3,7], 我國(guó)僅有該屬記錄一種。環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)(Otostephanos torquatus)在我國(guó)蛭態(tài)輪蟲(chóng)研究中未被報(bào)道過(guò), 作為敖突輪屬的常見(jiàn)種, 該輪蟲(chóng)初始發(fā)現(xiàn)于苔蘚樣品中, 營(yíng)自由生活, 攝食時(shí), 其形態(tài)發(fā)生改變, 輪盤(pán)從頭部伸展出來(lái), 轉(zhuǎn)動(dòng)輪盤(pán)上的纖毛通過(guò)濾食方式經(jīng)咀嚼器的作用將食物儲(chǔ)存在內(nèi)腔(Lumen)的食物泡中, 然后以“糞丸”的形式排出體外。

本研究通過(guò)對(duì)環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)形態(tài)學(xué)特征描述,咀嚼器掃描電鏡圖片和COⅠ序列分析, 對(duì)該種的鑒定進(jìn)行進(jìn)一步確定。為我國(guó)今后蛭態(tài)輪蟲(chóng)分類(lèi)和物種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與活體輪蟲(chóng)獲取

于2018年4月11日在廣東省珠海市萬(wàn)山群島(N21°56′15.81", E113°43′5.77")采集苔蘚樣品, 苔蘚著生于石壁上, 常年處于陰暗潮濕的環(huán)境, 該苔蘚植物含水量豐富, 適合蛭態(tài)輪蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖。慢慢將苔蘚撕下, 并放置于牛皮種子袋中, 待室溫自然風(fēng)干后密封保存。

對(duì)于附蘚蛭態(tài)輪蟲(chóng)的提取, 采取震蕩復(fù)蘇法,取少量風(fēng)干后的苔蘚樣品置于50 mL離心管中, 加入約40 mL純水浸泡樣品, 水需沒(méi)過(guò)苔蘚, 放置0.5h及以上, 劇烈震蕩離心管, 將苔蘚與附著的蛭態(tài)輪蟲(chóng)分離, 等待蛭態(tài)輪蟲(chóng)從休眠狀態(tài)復(fù)蘇, 后經(jīng)20 μm篩網(wǎng)過(guò)濾, 加純水重復(fù)過(guò)濾5—10次, 以便獲取更多的輪蟲(chóng), 此方法僅適用于蛭態(tài)輪蟲(chóng)的定性分析[8,9]。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

使用顯微鏡(OLYMPUS BX51)進(jìn)行外部形態(tài)學(xué)觀察, 通常狀態(tài)下蛭態(tài)輪蟲(chóng)處于未攝食狀態(tài), 待蛭態(tài)輪蟲(chóng)開(kāi)始攝食后拍攝其頭冠、咀嚼器等重要的分類(lèi)學(xué)依據(jù), 分類(lèi)依據(jù)參考《Ordnung Bdelloidea》[10]。拍照后用T Capture軟件測(cè)量該輪蟲(chóng)各部位長(zhǎng)度, 測(cè)量模型參考Iakovenko等[11]。輪蟲(chóng)形態(tài)模式圖使用Adobe illustrator CS6 2017軟件繪制。

1.3 咀嚼器掃描電鏡制片

在載玻片上滴加微量甘油, 將方形蓋玻片(邊長(zhǎng)0.9 cm)固定于載玻片上, 保證蓋玻片和載玻片表面均干凈無(wú)雜質(zhì)。用毛細(xì)玻璃管吸取一只蛭態(tài)輪蟲(chóng)放在蓋玻片上(吸取的水滴盡可能小), 加入3%次氯酸鈉溶液將輪蟲(chóng)溶解, 顯微鏡下觀察蟲(chóng)體的溶解過(guò)程, 然后用毛細(xì)管將次氯酸鈉溶液吸出, 加入超純水沖洗5—10次, 直至咀嚼器周?chē)鸁o(wú)雜質(zhì)和結(jié)晶,用馬克筆標(biāo)記咀嚼器的位置, 24h自然風(fēng)干后, 噴金后在掃描電子顯微鏡(ZEISS EVO/MA15)下拍攝觀察該輪蟲(chóng)咀嚼器形態(tài), 具體咀嚼器制備過(guò)程參考De Smet[12]。

1.4 蛭態(tài)輪蟲(chóng)COⅠ基因克隆及序列分析

挑取環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)若干只置于載玻片上, 用純水清洗至表面無(wú)雜質(zhì), 將單個(gè)蟲(chóng)體放入0.2 mL PCR管中, 使用Hotshot方法提取單只蛭態(tài)輪蟲(chóng)樣品的DNA[13], 向PCR管中加入堿性裂解液10 μL, 95℃裂解0.5h后取出立即放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍5min,冷卻后加入中和液10 μL, 即完成蛭態(tài)輪蟲(chóng)的DNA提取, 隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物后測(cè)序。引物反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性1min→95℃變性40s→48℃退火40s→62℃延伸45s,循環(huán)5次 →94℃變性40s→ 循環(huán)退火40s→ 循環(huán)延伸45s, 循環(huán)35次, 最后72℃延伸5min→保存[14]。該過(guò)程使用引物為(ZplankF1_t1: TGTAAAACGACG GCCAGTTCTASWAATCATAARGATATTGG;ZplankR1_t1: CAGGAAACAGCTATGACTTCAG GRTGRCCRAARAATCA)[15]。測(cè)序結(jié)果與NCBI上已有序列進(jìn)行Blast比對(duì), 尋找親緣關(guān)系相近的物種, 將測(cè)序結(jié)果經(jīng)Bioedit軟件處理后, 使用MEGA7.0軟件分析該輪蟲(chóng)與同科及同屬輪蟲(chóng)COⅠ序列之間的遺傳距離, 采用鄰接法(Neighbor-Joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖 1 環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristic of O. torquatus

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)身體縱長(zhǎng)(圖 1), 主要分為頭部,軀干和足部三個(gè)部分, 無(wú)眼點(diǎn), “卵生”。體內(nèi)器官呈黃棕色, 表皮較光滑, 無(wú)附著大顆粒雜質(zhì), 有明顯的縱長(zhǎng)條紋。頭部頂端的“吻突”內(nèi)有二分裂半圓形喙片, 長(zhǎng)有細(xì)短的纖毛。蟲(chóng)體最寬處通常位于軀干的后半部, 頸部較長(zhǎng), 背觸手較短, 足部較短, 刺戟近似三角形, 趾3個(gè); 體內(nèi)含有大小不等的食物泡, 卵巢兩個(gè), 軀干兩側(cè)各一個(gè)(圖 2)。該輪蟲(chóng)處于正?；顒?dòng)狀態(tài)時(shí), 輪盤(pán)位于頭的內(nèi)部, 不伸展, 趾吸附在附著物上, 依靠縱行肌的收縮前進(jìn)。在攝食狀態(tài)下, 輪盤(pán)從頭部伸出, 左右各一個(gè), 寬度明顯大于頭部, 通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)其上方的纖毛進(jìn)行濾食, 食物經(jīng)咀嚼器儲(chǔ)存在內(nèi)腔的食物泡中。食物泡是宿輪科輪蟲(chóng)特有的結(jié)構(gòu), 食物在食物泡中被消化利用后, 整個(gè)食物泡通過(guò)泄殖腔以球形糞丸排出體外。頭冠外側(cè)帶有特殊圓環(huán)狀結(jié)構(gòu), 上唇裂片呈三角狀且裂片高度明顯低于輪盤(pán)的高度, 此時(shí)頭部寬度大于其長(zhǎng)度。咀嚼器為蛭態(tài)輪蟲(chóng)特有的枝型咀嚼器, 齒式為7/7, 還存在若干細(xì)長(zhǎng)的肋條狀小齒(圖 3)。

2.2 不同生長(zhǎng)狀態(tài)的形態(tài)學(xué)變化

挑取樣品中的環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)進(jìn)行各部位長(zhǎng)度測(cè)量(n=10)。結(jié)果如下: 體長(zhǎng)(331±41.8) μm, 頭部長(zhǎng)度(22.8±1.7) μm, 頭部寬度(27.9±2.6) μm, 頭冠寬度(38.9±2.6) μm, 頸長(zhǎng)(54.5±5.9) μm, 足部長(zhǎng)(22.7±3.0) μm, 刺戟長(zhǎng)(8.4±0.9) μm。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn), 該輪蟲(chóng)在生長(zhǎng)過(guò)程中, 蟲(chóng)體大小的改變主要取決于軀干部的長(zhǎng)度, 頭部和趾的長(zhǎng)度在蟲(chóng)體整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú)明顯變化。

圖 2 環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)背面觀Fig. 2 Dorsal view of Otostephanos torquatus

圖 3 環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)咀嚼器掃描電鏡照片(ma. 咀嚼器齒式, 比例尺為2 μm)Fig. 3 Trophi of Otostephanos torquatus (ma. major teeth, scale bar=2 μm)

2.3 遺傳距離和進(jìn)化樹(shù)分析

從GenBank中下載與環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)COⅠ基因序列相似度高的物種的COⅠ基因序列, 通過(guò)MEGA7.0分析這些物種的遺傳距離。由于Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)的COⅠ基因序列,我國(guó)對(duì)同屬的多納敖突輪蟲(chóng)(Otostephanos donneri)的描述也僅限于形態(tài)特征, 選擇基因庫(kù)中同屬的多納敖突輪蟲(chóng)的COⅠ基因序列聚類(lèi)分析, 以旋輪科的Pleuretra lineata及盤(pán)網(wǎng)輪科的游蕩盤(pán)網(wǎng)輪蟲(chóng)(Adineta vaga)作為環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)的外類(lèi)群, 宿輪科宿輪屬的Habrotrocha constricta作為同科物種,使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 聚類(lèi)分析結(jié)果表明該輪蟲(chóng)的遺傳位置屬于蛭態(tài)亞綱、宿輪科、敖突輪屬(圖 4)。

3 討論

目前蛭態(tài)輪蟲(chóng)的物種鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)分類(lèi)。咀嚼器作為蛭態(tài)輪蟲(chóng)的重要特征, 為種類(lèi)鑒定提供了較全面的分類(lèi)學(xué)依據(jù)[16]。不同蛭態(tài)輪蟲(chóng)咀嚼器的大小和齒的形式等方面都會(huì)存在明顯差異。由于咀嚼器尺寸較小, 采用掃描電鏡可以使咀嚼器的齒式以及細(xì)節(jié)特征更加清晰。在傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的基礎(chǔ)上, 通過(guò)對(duì)蛭態(tài)輪蟲(chóng)COⅠ基因的提取和序列分析, 為蛭態(tài)輪蟲(chóng)的物種鑒定提供更加可靠的分子生物學(xué)依據(jù)。

3.1 分類(lèi)背景

全世界蛭態(tài)亞綱輪蟲(chóng)目前共記錄4科19屬461種[17], 我國(guó)共記錄蛭態(tài)輪蟲(chóng)3科9屬42種, 敖突輪屬全球共記錄15種, 我國(guó)僅記錄1種[18]。對(duì)于蛭態(tài)輪蟲(chóng)的分類(lèi)學(xué)地位, 我國(guó)一般將其歸類(lèi)于輪蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)、雙巢綱、蛭態(tài)目[19]。根據(jù)最新的分類(lèi)學(xué)研究,目前國(guó)際上將蛭態(tài)輪蟲(chóng)歸類(lèi)于蛭態(tài)亞綱[17,20,21]。相對(duì)于國(guó)外, 我國(guó)對(duì)蛭態(tài)類(lèi)輪蟲(chóng)的分類(lèi)和物種鑒定尚處于起步階段。

3.2 敖突輪屬特征及其與國(guó)內(nèi)外相關(guān)物種的比較

輪盤(pán)上帶有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為該屬特有的分類(lèi)特征, 且該屬輪蟲(chóng)咀嚼器的齒式, 有助于食物在體內(nèi)形成“食物泡”。咀嚼器的齒式是蛭態(tài)亞綱輪蟲(chóng)進(jìn)行物種鑒定的重要分類(lèi)特征。生活在不同生境的環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)個(gè)體間咀嚼器齒的形式存在差異, 在我國(guó)分布的該種咀嚼器齒式為7/7, 相較于歐洲, 該種咀嚼器齒式有6/6、7/7、8/8三種形態(tài)[11]。在蛭態(tài)輪蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)物種鑒定的基礎(chǔ)上, 可以結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)輪蟲(chóng)進(jìn)行基因測(cè)序, 從基因?qū)用嫔线M(jìn)一步支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

我國(guó)敖突輪屬的記錄僅有一種, 即多納敖突輪蟲(chóng)(Otostephanos donneriBartos, 1959)[18], 該種發(fā)現(xiàn)在我國(guó)云南省, 作者僅把多納敖突輪蟲(chóng)作為輪蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)的種類(lèi)組成記錄, 沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行具體的形態(tài)學(xué)描述。環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)和多納敖突輪蟲(chóng)除了體內(nèi)含有食物泡, 輪盤(pán)帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)等共有特征外, 蟲(chóng)體大小長(zhǎng)度相近, 上唇形狀也極其相似。但在生活環(huán)境、咀嚼器形態(tài)、刺戟形態(tài)等方面都有明顯差異。通過(guò)國(guó)外對(duì)多納敖突輪蟲(chóng)的形態(tài)描述, 兩個(gè)種的生境和形態(tài)對(duì)比如表 1所示。

環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)在韓國(guó)和意大利地區(qū)也有記載[4,22],對(duì)比該輪蟲(chóng)在這三個(gè)地區(qū)的生存環(huán)境, 此物種均棲息在苔蘚植物水膜中, 迄今, 未在其他環(huán)境中發(fā)現(xiàn)該物種。對(duì)比三個(gè)區(qū)域該種的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征, 未發(fā)現(xiàn)明顯差異。通過(guò)對(duì)比我國(guó)與意大利和韓國(guó)的地理位置, 三個(gè)國(guó)家的經(jīng)緯度跨度較大, 屬于不同地理板塊, 因此推測(cè)該輪蟲(chóng)在全球分布范圍較廣, 可以適應(yīng)不同的氣候類(lèi)型和溫度變化。對(duì)于某一種蛭態(tài)輪蟲(chóng)來(lái)說(shuō), 具有類(lèi)似細(xì)菌和原生動(dòng)物的全球分布特征, 這種高擴(kuò)散能力, 對(duì)孤雌生殖的蛭態(tài)輪蟲(chóng)能夠在地球上長(zhǎng)期存在具有重要意義[23,24]。

圖 4 基于環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 The Neighbor-joining tree based on CO Ⅰgene sequences of Otostephanos torquatus

表 1 我國(guó)新記錄種環(huán)頸敖突輪蟲(chóng)與已有記錄多納敖突輪蟲(chóng)的對(duì)比Tab. 1 Comparison of the newly recorded species Otostephanos torquatus and the existing record of O. donneri in China

3.3 展望

我國(guó)對(duì)蛭態(tài)輪蟲(chóng)的研究基本處于空白, 主要?dú)w結(jié)于三個(gè)方面的原因: (1)蛭態(tài)輪蟲(chóng)生境多樣, 研究者對(duì)各種生境蛭態(tài)輪蟲(chóng)的提取方法不熟悉; (2)缺少蛭態(tài)輪蟲(chóng)物種鑒定的參考文獻(xiàn)和書(shū)籍。目前對(duì)蛭態(tài)輪蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定主要參考德文版的《Ordnung Bdelloidea》[10], 語(yǔ)言限制性大; (3)蛭態(tài)輪蟲(chóng)無(wú)背甲, 易收縮, 活體狀態(tài)下難以獲得其形態(tài)學(xué)信息。隨著科技水平的發(fā)展和研究手段的進(jìn)步, 通過(guò)先進(jìn)的攝影設(shè)備拍攝蛭態(tài)輪蟲(chóng)的形態(tài)特征, 使用電鏡、DNA測(cè)序等多重手段可擴(kuò)展蛭態(tài)輪蟲(chóng)的研究范圍。

我國(guó)領(lǐng)土南北緯度跨越近50°, 高原、盆地、平原等地形復(fù)雜多樣, 各地區(qū)蛭態(tài)輪蟲(chóng)多樣性分布也會(huì)有所差異。蛭態(tài)輪蟲(chóng)在全球從南極到赤道各個(gè)緯度區(qū)域均有分布, 可以適應(yīng)多樣的生境變化[25]。我國(guó)具有獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì), 因此, 加強(qiáng)苔蘚、水體、土壤和地衣等不同棲息地和不同生物地理格局的蛭態(tài)輪蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)研究非常重要。隨著先進(jìn)攝影設(shè)備、電鏡技術(shù)和分子測(cè)序等多種技術(shù)方法的應(yīng)用, 有望在我國(guó)發(fā)現(xiàn)更多的蛭態(tài)輪蟲(chóng)種類(lèi)。

近年來(lái), 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 國(guó)際學(xué)者對(duì)蛭態(tài)輪蟲(chóng)的隱生行為和孤雌生殖領(lǐng)域的分子生物學(xué)研究有重大進(jìn)展。從基因組層面分析低濕休眠中出現(xiàn)的耐干燥性等分子特征, 得出不同生境的蛭態(tài)輪蟲(chóng)在基因結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異[26]。生態(tài)學(xué)方面, 不同種類(lèi)的蛭態(tài)輪蟲(chóng)可以以整體形式作為小型水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的生物指標(biāo)[27]。通過(guò)對(duì)大樣本蛭態(tài)輪蟲(chóng)線(xiàn)粒體COⅠ基因的測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 結(jié)果表明不同的蛭態(tài)輪蟲(chóng)具有不同的生態(tài)位和棲息地偏好[28]。因此在野外調(diào)查過(guò)程中, 調(diào)查不同生境, 獲取更多具有棲息地偏好的物種, 對(duì)分子生物學(xué)和生物學(xué)等方面的進(jìn)一步研究具有重要意義。