田瑩瑩 吳幸強(qiáng) 姬燕培 馮秀芳 肖邦定

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;2. 河南工學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453003)

不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(Anoxygenic Phototrophic Bacteria, AnPB)分布廣泛[1,2], 在碳、氮、磷等元素的地球生物化學(xué)循環(huán)過程中扮演著重要的角色[3,4]。在水生態(tài)系統(tǒng)中, 不產(chǎn)氧的紫色非硫光合細(xì)菌(Purple Nonsulfur Bacteria, PNSB)可見于藍(lán)藻形成的微生物墊及沉積物表層[5]。因其靈活多樣的代謝模式, PNSB常被應(yīng)用于有機(jī)廢水處理和水體凈化過程[6—8]。此外, PNSB, 尤其是紅假單胞菌屬(Rhodopseudonassp.)光合細(xì)菌, 在生物制氫及土壤生態(tài)修復(fù)等過程均可起到顯著作用[9,10]。開展特定生境中光合細(xì)菌的分離鑒定及生理特性研究工作,對(duì)提高光合細(xì)菌污染凈化能力認(rèn)識(shí), 挖掘光合細(xì)菌潛在應(yīng)用價(jià)值具有重要的意義。

不產(chǎn)氧光合細(xì)菌都使用某種形式的細(xì)菌葉綠素(Bacteriochloroghyll, Bchl)作為其主要的光合色素, 且只有唯一的細(xì)菌葉綠素-蛋白質(zhì)反應(yīng)中心(RC-1或RC-2)[11,12]。與高等植物有兩個(gè)獨(dú)立的光反應(yīng)系統(tǒng)(Photosynthetic system, PS)不同的是,PNSB光反應(yīng)中心只有一個(gè)(RC-2), 結(jié)構(gòu)類似于高等植物光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)[13]。調(diào)制葉綠素?zé)晒?Pulse-Amplitude-Modulation, PAM)具有測(cè)量快速、簡(jiǎn)單、可靠的特點(diǎn), 且測(cè)量過程對(duì)樣品生長(zhǎng)基本無影響, 是研究光合作用的強(qiáng)大工具[14,15], 對(duì)實(shí)現(xiàn)光合細(xì)菌生理指標(biāo)的快速監(jiān)測(cè)具有重要意義。目前已有學(xué)者利用調(diào)制葉綠素?zé)晒庋芯縍C-2型不產(chǎn)氧光合細(xì)菌光合反應(yīng)器中能量和電子傳遞過程[16—18]。

本研究從武漢東湖沉積物中分離得到1株紫色非硫光合細(xì)菌, 對(duì)其細(xì)菌形態(tài)、特征吸收光譜、系統(tǒng)發(fā)育信息、蛋白質(zhì)含量、ATP酶(ATPase)活性、光合作用及適宜生長(zhǎng)條件等生理特性進(jìn)行了研究,旨在提高人們對(duì)光合細(xì)菌的認(rèn)識(shí), 并為調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)用于光合細(xì)菌生理特性表征提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

采集東湖表層沉積物樣品。移取適量靜置沉淀后的上清液至250 mL碘量瓶, 加入ATYP光合細(xì)菌富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集。ATYP富集培養(yǎng)基購(gòu)于山東拓普生物工程有限公司。富集過程中瓶口用水密封。于光照強(qiáng)度1000 lx, 28℃恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)物呈現(xiàn)明顯的紅色, 進(jìn)行后續(xù)分離純化。

1.2 分離純化

采用雙層平板法分離光合細(xì)菌, 所用分離培養(yǎng)基為含1.5%瓊脂的上述富集培養(yǎng)基。將富集培養(yǎng)后的菌懸液梯度稀釋后均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面。待涂布液被吸收后在其上傾倒一層同體積的固體瓊脂培養(yǎng)基。將制好的平板置于透光度較好的抽真空的干燥器中培養(yǎng)1—2周(1000 lx, 28℃)。用牙簽挑取兩層瓊脂間紅色菌落, 反復(fù)涂布、劃線、分離, 至鏡檢無雜菌且整個(gè)培養(yǎng)基表面為單一形態(tài)菌落, 得到供試菌株, 命名為PUF1。

1.3 光合細(xì)菌種子液的制備

用滅菌的牙簽挑取平板上的單菌落, 轉(zhuǎn)入裝有2 mL ATYP液體培養(yǎng)基的血清瓶中預(yù)培養(yǎng), 后逐級(jí)放大培養(yǎng)至100 mL。于28℃、光照強(qiáng)度1000 lx下培養(yǎng)。

1.4 菌株鑒定

細(xì)菌分子鑒定所獲得的純菌株的分子鑒定通過擴(kuò)增紫色非硫光合細(xì)菌光反應(yīng)中心蛋白M亞基編碼的puf M基因進(jìn)行, 所用特異性引物對(duì)為puf M 557F/750R[19]。取2 mL純培養(yǎng)菌懸液, 離心收集菌體沉淀, 用細(xì)菌DNA提取試劑盒(OMEGA Bio-Tek)提取細(xì)菌總DNA, 提取步驟按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×TaqMasterMix(CWBIO)10 μL, 無菌水8.5 μL, 引物各0.5 μL(10 pmol), DNA模板 0.5 μL。擴(kuò)增條件: 94℃ 3min, 94℃ 30s; 59℃30s; 72℃ 1min; 39個(gè)循環(huán); 72℃ 7min。將純化后PCR產(chǎn)物連接至pMD-18T載體, 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)選取正確插入片段的陽性重組克隆, 送測(cè)序公司測(cè)序。所得基因序列采用BioEdit軟件進(jìn)行組裝, 去除載體序列, 同時(shí)上傳序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 獲得登錄號(hào)(KU886140)。將測(cè)序得到的序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì), 下載與其相似序列, 應(yīng)用BioEdit中的ClustalW Multiple aligment程序進(jìn)行多序列聯(lián)配, 用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

吸收光譜的測(cè)定取適量體積的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液兩份, 離心去除培養(yǎng)液, 一份用60%蔗糖溶液重懸后進(jìn)行活細(xì)胞吸收光譜全波長(zhǎng)掃描, 另一份用100%甲醇提取菌體色素, 取離心上清液進(jìn)行色素吸收光譜全波長(zhǎng)掃描(Cary WinUV, 安捷倫, 美國(guó))。波長(zhǎng)為200—1000 nm, 掃描速度為600 nm/min。

掃描電鏡觀察預(yù)先在光合細(xì)菌培養(yǎng)裝置中放入0.5 cm×0.5 cm玻璃片, 待細(xì)菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期取出。用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液清洗玻片兩次, 后用2.5%戊二醛固定液固定2h。在固定液清洗后, 進(jìn)行脫水, 脫水梯度為50%乙醇10min, 70%乙醇15min, 80%乙醇15min, 90%乙醇15min, 無水乙醇15min(兩次), 2:1乙醇-叔丁醇15min, 1:1乙醇-叔丁醇15min, 叔丁醇15min(兩次)。真空冷凍干燥后,取出玻片, 黏附于導(dǎo)電膠上, 上機(jī)(S-4800, Hitachi,日本)觀察。

透射電鏡觀察透射電鏡(HT-7700, Hitachi,日本)用于觀察PUF1超微結(jié)構(gòu)。樣品前處理過程包括包埋塊的制備、包埋塊的修整及超薄切片制備,由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所分析測(cè)試中心負(fù)責(zé)完成。

1.5 細(xì)菌生物量測(cè)定

將新接種的細(xì)菌培養(yǎng)體系暗適應(yīng)2h后, 于連續(xù)光照(1000 lx)、室溫(28±1)℃培養(yǎng)。定期取樣, 于波長(zhǎng)650 nm測(cè)定培養(yǎng)液吸光度(A650)。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線用Logistic模型擬合:

式中a值為Amax,xc為到達(dá)生長(zhǎng)曲線拐點(diǎn)處(即1/2a值)的時(shí)間,k為特定生長(zhǎng)速率(/h)。

1.6 溶解氧、pH、光照強(qiáng)度的測(cè)定

培養(yǎng)液中溶解氧(DO)用微電極測(cè)定(Unisense,丹麥)。使用前用75%酒精沖洗溶解氧玻璃電極兩次。步距為0.5 mm, 測(cè)定體系中DO的垂直變化情況。

用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至6.00、6.64、7.30和8.00, 觀察PUF1在不同pH條件下生長(zhǎng)狀態(tài)。pH的測(cè)定用pH計(jì)(YSI pH 100A, 美國(guó))。

光照強(qiáng)度梯度設(shè)置為: 100(室內(nèi)自然光)、500、1000和3000 lx。光照強(qiáng)度用照度計(jì)測(cè)定(ZDS-10F-2D, 上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠, 中國(guó))

1.7 元素組成分析

取冷凍干燥的生長(zhǎng)穩(wěn)定期細(xì)菌菌粉用于元素組成分析。細(xì)菌碳(C)、氮(N)含量的測(cè)定用元素分析儀完成(Vario EL cube, Elementar, 德國(guó))。菌體含磷(P)量采用過硫酸鉀消解, 鉬藍(lán)比色法。細(xì)菌粗灰分(Ash)的測(cè)定采用灼燒法。

1.8 蛋白質(zhì)含量及ATP酶活性測(cè)定

取適量體積光合細(xì)菌菌懸液, 高速離心(10000×g, 10min), 盡棄上清液, 用0.85%生理鹽水反復(fù)洗滌菌體沉淀多次。半微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

制備適宜濃度的細(xì)胞懸液(107/mL), 用超聲粉碎器破碎(冰浴), 搖勻后用于ATP酶(ATPase)活性的測(cè)定。ATPase活性的測(cè)定采用南京建成細(xì)胞微量ATP酶試劑盒進(jìn)行。

測(cè)定細(xì)菌蛋白質(zhì)、ATPase活性的同時(shí), 取樣測(cè)定650 nm處培養(yǎng)液吸光度A650。

1.9 光合作用測(cè)定

用水樣調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Water-PAM, WALZ,德國(guó))測(cè)定純培養(yǎng)條件下PUF1光合作用。調(diào)節(jié)增益(Gain)使瞬時(shí)穩(wěn)態(tài)熒光(Ft)在200至600之間變化, 測(cè)定PS II最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。測(cè)定快速光曲線時(shí), 預(yù)先暗適應(yīng)15min。光強(qiáng)度梯度為221、327、499、746、1058、1469、2410和3516 μmol photons/(m2·s), 兩步間隔15s, 光飽和脈沖在3000 μmol photons/(m2·s), 得到最大光利用系數(shù)(alpha)及最大電子傳遞速率(ETRm)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

用Excel整理數(shù)據(jù), 采用Origin 8.0作圖。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 光合細(xì)菌鑒定

菌落的形態(tài)特征平板計(jì)數(shù)PUF1時(shí)發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)于培養(yǎng)基表面的菌落周圍呈乳白色, 且菌落個(gè)體較大, 而位于兩層固體瓊脂之間菌落相對(duì)較小,通體呈紫紅色(圖 1)。

圖 2為光合細(xì)菌掃描電鏡圖, 可以看出光合細(xì)菌呈直的或稍彎曲的桿狀, 或成簇或零散分布于玻璃載體表面。生長(zhǎng)穩(wěn)定期PUF1大小為長(zhǎng)3.05—10.06 μm,直徑0.32—0.68 μm。

圖 3為透射電鏡下光合細(xì)菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖,表明光合細(xì)菌具有明顯的片層膜結(jié)構(gòu)。序列比對(duì)結(jié)果顯示PUF1與R.palustris的相似性最高, 推測(cè)所分離PUF1為紅假單胞菌屬的沼澤紅假單胞菌, 下載與其相似序列, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖 4)。

光合細(xì)菌掃描光譜細(xì)菌懸液掃描譜圖結(jié)果顯示, PUF1在波長(zhǎng)377、460、490、592、807、865和980 nm處有較明顯吸收峰(圖 5A), 其中377、807和865 nm是細(xì)菌葉綠素a(Bchla)特征吸收峰,592和980 nm是細(xì)菌葉綠素b(Bchlb)的特征吸峰。PUF1菌體甲醇提取物呈青色, 波長(zhǎng)460至540 nm處三個(gè)連續(xù)吸收峰是由類胡蘿卜素引起的, 波長(zhǎng)771 nm處特征吸收峰由Bchla引起(圖 5B)。

在PUF1培養(yǎng)過程中血清瓶上部為少量無菌空氣, 依靠微生物自身生命活動(dòng)消耗溶液中的氧(DO)。實(shí)驗(yàn)過程中測(cè)定了不同培養(yǎng)時(shí)間(3d、4d和7d)體系中DO的垂直變化情況。結(jié)果顯示, 培養(yǎng)過程中有氧層厚度在0.5 cm; 液面下0.5至1 cm為缺氧-厭氧過渡階段, DO小于0.5 mg/L; 液面以下1 cm,培養(yǎng)體系完全厭氧(圖 6)。

2.2 元素組成

穩(wěn)定期PUF1菌體C、N、P元素含量如表 1所示。除去灰分部分, PUF1菌體C、N相對(duì)含量分別為53.75%和10.35%, C/N摩爾比為6.06。

圖 1 平板計(jì)數(shù)PUF1Fig. 1 Colony enumeration of PUF1

圖 2 PUF1掃描電鏡圖Fig. 2 The scanning electron microscopic image of PUF1

圖 3 PUF1透射電鏡圖Fig. 3 The transmission electron microscopic image of PUF1

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)和光合作用的影響

pH對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)和光合作用的影響微生物活動(dòng)是由一系列酶促反應(yīng)參與完成的, 維持pH在適宜范圍對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有重要意義。如圖 7所示, PUF1生長(zhǎng)延遲期為12h, 5—6d達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期。PUF1生長(zhǎng)曲線適用Logistic模型(R2≥0.97)。初始pH 6.00—8.00, 穩(wěn)定期細(xì)菌生物量無顯著差異。初始pH 6.64, PUF1生長(zhǎng)速率最快(k, 0.064/h), 生長(zhǎng)周期最短(xc, 49.59h)。pH偏酸(pH 6.00)或偏堿(pH 8.00), PUF1生長(zhǎng)速率較慢(k, 0.051/hvs. 0.041/h)。pH 8.0時(shí)PUF1生物量較高(A650, 1.38), 這可能與PUF1初始接種濃度稍高有關(guān)。

圖 4 菌株P(guān)UF1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Strain PUF1 and related strains

圖 5 PUF1細(xì)菌懸液及甲醇提取物吸收光譜圖(A. 細(xì)菌懸液; B.甲醇提取物)Fig. 5 Absorption spectra of the intact cell suspension (A) and methanol extract (B) of strain PUF1

此外, 實(shí)驗(yàn)考察了不同初始pH培養(yǎng)條件下PUF1光合作用參數(shù)的變化(圖 8)。實(shí)驗(yàn)6d, 各處理組Fv/Fm與pH分別為: 初始pH 6.00,Fv/Fm0.10(pH 7.72±0.33), 初始pH 6.64,Fv/Fm0.12(pH 7.95±0.28),初始pH 7.30,Fv/Fm0.08(pH 8.39±0.21)。由圖 8D可知, 初始pH 8.00, 實(shí)驗(yàn)2d,Fv/Fm為0(pH 8.4), 光合活性下降顯著。由圖 8B和圖 8C也可看出, 實(shí)驗(yàn)3d初始pH 6.64升高至8.03, 初始pH 7.30升高至8.32,此條件下Fv/Fm、α顯著降低。以上結(jié)果表明, 培養(yǎng)體系pH高于8.00或?qū)UF1光合作用有顯著抑制。

圖 6 不同培養(yǎng)時(shí)間溶解氧的垂直變化Fig. 6 The vertical profile of dissolved oxygen at different culture times

表 1 菌株P(guān)UF1主要元素含量Tab. 1 Proportion of major elements of strain PUF1

圖 7 不同初始pH條件下PUF1生長(zhǎng)曲線Fig. 7 The growth curve of PUF1 from different initial pH

光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)和光合作用的影響如圖 9所示, 光照強(qiáng)度500—3000 lx(初始pH 6.8), 穩(wěn)定期細(xì)菌生物量無顯著差異, 其中光照強(qiáng)度3000 lx, 細(xì)菌生長(zhǎng)速率最快(k, 0.059/h), 生長(zhǎng)周期最短(xc, 59.30h)。當(dāng)光照強(qiáng)度為100 lx時(shí), 細(xì)菌增長(zhǎng)緩慢。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 在四組光照強(qiáng)度下, 培養(yǎng)體系pH均小于8.0。光照強(qiáng)度500—3000 lx,Fv/Fm變化規(guī)律為遲滯期較低, 對(duì)數(shù)期較高, 穩(wěn)定期降低; 光照強(qiáng)度100 lx,Fv/Fm在培養(yǎng)初期(0—60h)稍有下降, 后呈直線上升趨勢(shì), 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Fv/Fm較高(0.17±0.02, 圖 10),這可能與體系內(nèi)較少的細(xì)菌生物量和充足的剩余營(yíng)養(yǎng)物有關(guān)。

2.4 光合細(xì)菌生長(zhǎng)周期內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP酶及光合活性的變化

光合細(xì)菌蛋白含量與ATP酶活性如圖 11所示, PUF1菌體蛋白含量在細(xì)菌生長(zhǎng)不同階段有所差異, 表現(xiàn)為適應(yīng)期含量低, 對(duì)數(shù)至穩(wěn)定期含量較穩(wěn)定且顯著高于適應(yīng)期蛋白含量(P＜0.05)。穩(wěn)定期PUF1蛋白質(zhì)含量為(634.09±4.3) mg/g, 超過菌體干重的60%, 可作為優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白來源。ATPase存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上, 是生物膜上的一種蛋白酶, 參與物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞等, 機(jī)體在脅迫狀態(tài)下, 此酶活力發(fā)生一系列改變。ATPase活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降, 推斷培養(yǎng)后期可能由于碳源、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏和細(xì)胞老化導(dǎo)致細(xì)胞ATPase活性下降顯著。

PUF1光合活性通過對(duì)Fv/Fm的監(jiān)測(cè)可在一定程度上反映PUF1的生長(zhǎng)狀態(tài), 為光合細(xì)菌的規(guī)?；囵B(yǎng)提供可行性指導(dǎo)。如圖 12所示, 在PUF1生長(zhǎng)周期內(nèi)Fv/Fm的變化規(guī)律符合單峰高斯模型(Gauss model), 拐點(diǎn)處A值為0.65(即1/2Amax), 表明對(duì)數(shù)期Fv/Fm最高, 而遲滯期與穩(wěn)定期Fv/Fm均相對(duì)較低。造成以上結(jié)果的原因, 主要可以歸納為以下兩部分。首先, 與培養(yǎng)體系中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用有關(guān), 主要為初期細(xì)菌需要適應(yīng)新的培養(yǎng)條件, 而穩(wěn)定期細(xì)菌生物可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如碳源)短缺使得PUF1光合作用受影響。此外, 光能利用率的降低也是不可忽略的因素, 一方面, PUF1貼壁生長(zhǎng), 影響反應(yīng)器透光性, 另一方面, 穩(wěn)定期PUF1生物量高,細(xì)菌相互遮擋, 都會(huì)影響光能的可利用性。應(yīng)用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)對(duì)RC-2型光合細(xì)菌資源開發(fā)及其快速監(jiān)測(cè)具有重要意義, 值得深入研究。

圖 8 光合作用參數(shù)與pH關(guān)系Fig. 8 Relationship of pH and photosynthesis parameters

3 討論

3.1 光合細(xì)菌的分離及特性

本研究利用雙層平板法, 從武漢東湖分離篩選出一株不產(chǎn)氧光合細(xì)菌, 所分離光合細(xì)菌與Ramana等[20]對(duì)紅假單胞菌屬光合細(xì)菌形態(tài)的觀察結(jié)果基本一致, 且具有明顯的片層膜結(jié)構(gòu), 與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris,R. palustris)WKUKDNS3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[21]高度相似。基于PUF1光反應(yīng)中心puf M功能基因片段測(cè)序結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)該菌株與沼澤紅假單胞菌親緣關(guān)系最近, 初步確定為紅假單胞菌屬紫色非硫光合細(xì)菌, 命名為Rhodopseudo-monas palustrisstrain PUF1。菌株P(guān)UF1特征吸收譜圖掃描結(jié)果與Okubo等[22]對(duì)豬場(chǎng)廢水溝渠光合細(xì)菌微生物墊的研究結(jié)果一致。菌株P(guān)UF1不同生長(zhǎng)階段其蛋白含量有所差異, 以穩(wěn)定期為最高, 可達(dá)細(xì)胞干重的60%, 是優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白。Carlozzi等[23]對(duì)R. palustris元素組成進(jìn)行了分析, 得出R. palustris元素組成為CH1.92N0.17O0.41(不考慮灰分部分)。在本研究中菌株P(guān)UF1 C、N元素含量與Carlozzi等[23]研究結(jié)果大體相當(dāng)。PUF1具有代謝藍(lán)藻生物質(zhì)的潛力, 以野外藍(lán)藻為培養(yǎng)基質(zhì), 干藻粉濃度1.67 g/L可顯著促進(jìn)PUF1增殖, 并可實(shí)現(xiàn)對(duì)體系內(nèi)氮、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再利用[24]。PUF1與其同源菌株R.palustrisTIE-1相似性為99%, 其中TIE-1具有從富含鐵、硫及其他礦物質(zhì)的沉積物中獲得電子的特性, 因而可將TIE-1用于電池生產(chǎn)過程[25], 而PUF1是否也同樣具備發(fā)電能力需進(jìn)一步研究。

圖 9 不同光照強(qiáng)度下PUF1生長(zhǎng)曲線Fig. 9 The growth curve of PUF1 from different light intensity

圖 10 光合作用參數(shù)與光照強(qiáng)度Fig. 10 Relationship of light intensity and photosynthesis parameters

紫色非硫光合細(xì)菌(PNSB), 尤其是紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonassp.)光合細(xì)菌分布廣泛, 代謝模式靈活, 對(duì)多種有機(jī)物降解作用顯著[7,10,22], 是生物制氫、黑臭水及水體富營(yíng)養(yǎng)化治理等領(lǐng)域中重要的候選微生物[8,9,24]。Okubo等[22]利用固體平板涂布和厭氧產(chǎn)氣袋結(jié)合的方法對(duì)豬場(chǎng)廢水溝渠中的PNSB進(jìn)行了分離, 發(fā)現(xiàn)紅細(xì)菌屬和紅假單胞菌屬占優(yōu)勢(shì)。Sharma等[21]利用同種分離方法, 從夏季設(shè)施豬場(chǎng)瀉湖樣品中分離得到一株沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustrisWKU-KDNS3, 好氧條件下能降解污水塘中廣泛存在的3-甲基吲哚惡臭物質(zhì)。尹樂斌等[26]利用雙層平板法從農(nóng)藥廠污水處理池分離得到一株高效降解氯氰菊酯農(nóng)藥的沼澤紅假單胞菌PSB07-13, 培養(yǎng)6d, 對(duì)50 mg/L氯氰菊酯的降解率可達(dá)80%。以上研究結(jié)果表明R.palustris在生態(tài)系統(tǒng)中可發(fā)揮廣泛的作用, 提高了人們對(duì)PNSB代謝多樣性的認(rèn)識(shí)。因此, 針對(duì)特定污染水域光合細(xì)菌的分離對(duì)后期水治理工作可發(fā)揮重要的適用性和實(shí)用性價(jià)值, 需深入研究。

3.2 環(huán)境因素對(duì)光合細(xì)菌的影響

靜水水體中低濃度的溶氧和簡(jiǎn)單有機(jī)質(zhì)的存在是導(dǎo)致PNSB驟增的重要因子[22]。對(duì)DO監(jiān)測(cè)結(jié)果表明, 采用ATYP培養(yǎng)基可為PUF1生長(zhǎng)營(yíng)造良好溶氧環(huán)境。有研究指出在振蕩培養(yǎng)條件下, PNSB色素合成能力喪失或降低, 培養(yǎng)物呈灰白色或微粉紅色[27], 細(xì)胞無增殖[28]或雖能生長(zhǎng), 但生長(zhǎng)量明顯低于靜止、微氧條件下的生長(zhǎng)量[27,29]。但DO對(duì)色素合成的脅迫作用是可逆的, 氧脅迫作用去除, 光合細(xì)菌又可恢復(fù)合成色素的能力。

圖 11 PUF1蛋白質(zhì)含量與ATPase活性的動(dòng)態(tài)變化Fig. 11 The dynamics of protein contents and ATPase activities of strain PUF1

圖 12 PUF1培養(yǎng)周期內(nèi)Fv/Fm變化Fig. 12 The variations of Fv/Fm in the whole culture period of PUF1

Choorit等[29]研究了Rhodopseudomonas palustrisKG31在乙酸、丙酸、丁酸及混合碳源培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)情況, 結(jié)果顯示, 在光照、微需氧條件下KG31生長(zhǎng)遲滯期為7.29—12.49h, 最大生長(zhǎng)速率為0.038—0.094/h。培養(yǎng)基pH低于5或等于10光合細(xì)菌均難以生長(zhǎng), 且在不同培養(yǎng)基中其最適pH范圍有所不同[27]。

已有研究表明, pH對(duì)光合作用有顯著影響。錐狀斯氏藻和塔瑪亞歷山大藻對(duì)pH的變化及其敏感,適宜pH為7.0—9.0, pH高于9.5時(shí), 不能進(jìn)行有效的光合作用[30]。隨著pH的升高, 金魚藻Fv/Fm與ETR相應(yīng)上升, pH高于10或低于7則均下降[31]。張虎等[32]研究了pH對(duì)小球藻光合作用、生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響, 發(fā)現(xiàn)pH為7.0—9.0, 光合放氧、生長(zhǎng)速率、生物質(zhì)產(chǎn)率、總酯含量和產(chǎn)率均保持在較高水平,而pH低于7.0或高于9.0, 上述指標(biāo)都顯著降低。Adessi等[16]研究了室外培養(yǎng)條件下R.palustris產(chǎn)氫與Fv/Fm關(guān)系, 結(jié)果顯示產(chǎn)氫階段Fv/Fm變化不顯著,在培養(yǎng)初期Fv/Fm維持在較低水平, 推測(cè)因需適應(yīng)室外高光條件導(dǎo)致。本研究利用Water-PAM測(cè)定了培養(yǎng)周期內(nèi)PUF1光合作用變化規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)Fv/Fm在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期較高, 而延遲期較低, 與上述研究結(jié)果一致。在室外培養(yǎng)條件下, 光照充足,Fv/Fm較高(0.55—0.65)[16], 而室內(nèi)培養(yǎng)光照較弱(100—3000 lx), 可能是導(dǎo)致Fv/Fm較低(小于等于0.3)的主要原因。pH在較小的范圍內(nèi)變化(pH 6.00—8.00)對(duì)細(xì)菌光合作用影響不明顯, 而當(dāng)培養(yǎng)體系pH高于8.00,Fv/Fm降低顯著, 因此PUF1規(guī)?；囵B(yǎng)過程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)pH的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。此外, 室外高光條件下,R.palustris培養(yǎng)過程中Fv/Fm較高, 為0.55—0.65, 這可能與充足的光補(bǔ)償有關(guān)。

光合細(xì)菌應(yīng)用前景廣闊, 快速監(jiān)測(cè)技術(shù)的開發(fā)在其規(guī)?；囵B(yǎng)過程中意義重大。目前, 有關(guān)pH對(duì)光合細(xì)菌光合作用的影響機(jī)制尚不清楚, 深入研究Fv/Fm、ATPase、蛋白質(zhì)等細(xì)菌生理生化指標(biāo)與培養(yǎng)體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的關(guān)系, 對(duì)全面和快速評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)具有重要意義。