王旭堂 刁志祥 張培楊 謝愷舟 王波 劉楚君 張跟喜 張濤 劉學(xué)忠 戴國俊

摘要：本研究旨在建立鵪鶉蛋和鴿蛋中甲砜霉素（TAP）殘留的超高效液相色譜-熒光檢測（UPLC-FLD）方法。以鵪鶉蛋和鴿蛋為試驗材料，采用加速溶劑萃取（ASE）技術(shù)提取目標(biāo)物，以乙腈飽和的正己烷去脂，凈化后用UPLC-FLD法進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，在鵪鶉蛋和鴿蛋中TAP的添加質(zhì)量比在定量限（LOQ）至250.0 μg/kg內(nèi)，線性關(guān)系良好，決定系數(shù)均大于0.999 2。TAP添加質(zhì)量比為LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL時，在鵪鶉蛋和鴿蛋中的回收率分別為83.23%～95.72%、84.37%～97.12%，檢測限（LOD）分別為3.4 μg/kg、3.3 μg/kg，LOQ分別為9.9 μg/kg、9.7 μg/kg。檢測方法快速、高效、靈敏度高，為鵪鶉蛋和鴿蛋中TAP殘留檢測提供了新方法。

關(guān)鍵詞：鵪鶉蛋;鴿蛋;甲砜霉素;加速溶劑萃取;超高效液相色譜-熒光檢測法

中圖分類號：S859.84文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0206-06

Abstract： This study aimed to establish an ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence detection （UPLC-FLD） method for the determination of thiamphenicol （TAP） residues in quail eggs and pigeon eggs. Using quail eggs and pigeon eggs as test materials， the target compound was extracted by accelerated solvent extraction （ASE） technique， and degreased by n-hexane saturated with acetonitrile. After purification， it was detected and analyzed by UPLC-FLD method. The results showed that the mass ratio of TAP in quail eggs and pigeon eggs was in the range of the limit of quantification （LOQ） to 250.0 μg/kg， and the linear relationship was good. The coefficients of determination were greater than 0.999 2. When TAP was added at mass ratios of LOQ， 0.5 maximum residue limit （MRL）， 1.0 MRL and 2.0 MRL， the recoveries in quail eggs and pigeon eggs were 83.23%-95.72%， 84.37%-97.12%， the detection limits were 3.4 μg/kg and 3.3 μg/kg， and the quantitative limits were 9.9 μg/kgand 9.7 μg/kg， respectively. The detection method used in this study is rapid， efficient and sensitive， which provides a new method for the detection of TAP residues in quail eggs and pigeon eggs.

Key words：quail eggs;pigeon eggs;thiamphenicol;accelerated solvent extraction;ultra-high performance liquid chromatography with fluorescence detection

甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP），別名硫霉素，甲砜氯霉素，是人工合成的氯霉素的同類物，屬于廣譜抗菌藥物。主要用于防治需氧革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌、厭氧菌、立克次體屬病菌、螺旋體病菌和衣原體屬病菌等引起的疾病。通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，起到抑菌效果。由于其對畜禽的多種細(xì)菌性疾病有良好的治療效果，在畜禽生產(chǎn)中已被廣泛使用。

禽蛋作為來源最廣，蛋白質(zhì)含量較高的動物性食品，近年來其需求量日益增大。而養(yǎng)殖者為了提高經(jīng)濟(jì)效益，常將TAP等抗生素藥物不合理地用于禽類，導(dǎo)致藥物殘留于禽蛋中。因為TAP具有較強(qiáng)的抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板生成的作用，影響人類健康，所以許多國家都對這種藥物的最高殘留限量做出了規(guī)定[1-3]。為了保證禽蛋的質(zhì)量安全，TAP的殘留檢測也日益重要。目前常用的檢測方法主要包括氣相色譜法（Gas chromatography，GC）[4-6]、氣質(zhì)聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[7-9]，液相色譜法（Liquid chromatography，LC）[10-12]和液質(zhì)聯(lián)用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[13-14]。國內(nèi)外利用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測動物性食品中TAP的研究多有報道，而利用超高效液相色譜法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）的報道較少。本研究采用了加速溶劑萃取（ASE）的方法，實現(xiàn)了提取劑與目標(biāo)物更好的接觸，提高萃取效率[15]，并利用UPLC分離，熒光檢測器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）檢測，建立了超高效液相色譜-熒光檢測法檢測鵪鶉蛋和鴿蛋中TAP殘留的方法，為鵪鶉蛋和鴿蛋中TAP殘留標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀（Acquity UPLC型），由美國Waters公司生產(chǎn);熒光檢測器（Acquity FLD型），由美國Waters公司生產(chǎn);加速溶劑萃取儀（ASE350型），由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn);離心濃縮儀（ScanSpeedVac40型），由丹麥LaboGene公司生產(chǎn);超純水制備儀（Smart2-Pure），由美國Thermo Scientific公司生產(chǎn);甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）（CAS號：15318-45-3），由德國Dr. Ehrenstorfer GmbH有限公司生產(chǎn);乙腈、甲醇（色譜純），由美國Tedia 有限公司生產(chǎn);十二烷基硫酸鈉（分析純，純度≥95.0%），由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);其他試劑均購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試驗用水為超純水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取甲砜霉素4.0 mg，用乙腈溶解、定容至10 ml，充分搖勻，配制成400.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分裝，密封，置-70 ℃超低溫冰箱中保存。將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用36%（體積比）的乙腈水溶液逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，分裝，密封，置-34 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，可穩(wěn)定保存30 d。

1.3樣品的提取與凈化

ASE提?。悍謩e準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02） g均質(zhì)好的鴿蛋和鵪鶉蛋樣品置于研缽中，與適量硅藻土研磨至粉末狀，以達(dá)到最佳的萃取效果。之后裝入22 ml萃取池（若池子留有空隙則用硅藻土填滿）中，放在加速溶劑萃取儀的機(jī)械臂上進(jìn)行萃取，萃取劑為2%的氨水乙腈，其萃取方法及參數(shù)如下：萃取壓力為1 500 psi，萃取溫度為80 ℃，萃取時間為5 min，萃取劑用量約為池體積的40%，每個樣品之間自動沖洗1次，氮氣吹掃時間60 s，靜態(tài)循環(huán)萃取2次，最后收集萃取液，待用。

樣品的凈化：將萃取液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管，置于離心濃縮儀（轉(zhuǎn)速為2 000 ?g）上濃縮接近干燥，加入1 ml純乙腈渦旋震蕩溶解殘渣，加入8 ml乙腈飽和的正己烷去脂，渦旋震蕩后靜置5 min，棄去上層正己烷，重復(fù)去脂1次，然后將萃取液置于離心濃縮儀上濃縮至干。將濃縮干燥后的樣品用2.0 ml流動相復(fù)溶，渦旋1 min，以12 100 ?g離心15 min，過0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）針式濾器，濾液供UPLC-FLD檢測。

1.4方法的建立

1.4.1色譜質(zhì)譜條件色譜柱（Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm），流動相A：超純水（含0.005 mol/L的NaH2PO4溶液，0.003 mol/L十二烷基硫酸鈉和0.05%的三乙胺，pH 5.3±0.1），流動相B：乙腈，等度洗脫A∶B=64∶36（體積比），檢測器：熒光檢測器（激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長284 nm），流速：0.2 ml/min，進(jìn)樣體積：10 μl，柱溫：30 ℃。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線分別準(zhǔn)確稱取10份（2.00±0.02） g勻漿好的鴿蛋和鵪鶉蛋的全蛋空白樣品，進(jìn)行提取和凈化后得到空白樣品基質(zhì)提取液。然后分別移取適量的基質(zhì)提取液將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成定量限（LOQ）、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg、100.0 μg/kg、150.0 μg/kg、200.0 μg/kg、250.0 μg/kg等系列質(zhì)量比，在UPLC-FLD條件下進(jìn)行分析。分別以甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同空白基質(zhì)中的添加質(zhì)量比為自變量（x），峰面積為因變量（Y），繪制甲砜霉素在鴿蛋和鵪鶉蛋中殘留量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3樣品回收率的測定分別準(zhǔn)確稱取（2.00±0.02） g勻漿好的空白鴿蛋和鵪鶉蛋樣品，將樣品與硅藻土研磨均勻后，分別加入甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，使其對應(yīng)在各空白樣品中的添加質(zhì)量比為LOQ、0.5 MRL（最高殘留限量）、1.0 MRL和2.0 MRL，攪拌混勻萃取，每個添加水平設(shè)置6個平行，經(jīng)提取凈化后，UPLC-FLD檢測，最后將檢測結(jié)果對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得質(zhì)量比，計算樣品回收率。

1.4.4精密度的測定精密度分為日內(nèi)（批內(nèi)）精密度和日間（批間）精密度，常用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來評估。日內(nèi)（批內(nèi)）精密度：同一天不同時間點用同一臺儀器和同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線測定，每個添加濃度設(shè)6個平行，求出日內(nèi)RSD。日間（批間）精密度：一周內(nèi)的不同天用不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線（每天都繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）同一臺儀器測定，每個添加質(zhì)量比設(shè)6個平行，求出日間RSD。

1.4.5檢測限與定量限測定取空白樣品進(jìn)行添加回收試驗，并用已建立的UPLC-FLD方法進(jìn)行分析。每個質(zhì)量比分析3次，得出信噪比（S/N）平均值。當(dāng)信噪比大于等于3（S/N≥3）時所對應(yīng)的添加質(zhì)量比即為分析方法的檢測限（LOD）;當(dāng)信噪比大于等于10（S/N≥10）時所對應(yīng)的添加質(zhì)量比即為分析方法的定量限（LOQ）。此外，LOQ質(zhì)量比點還應(yīng)滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求（一般要求回收率>70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤20%），才能證明此分析方法可靠。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與決定系數(shù)

由圖1和圖2可以看出，甲砜霉素在鴿蛋和鵪鶉蛋中添加質(zhì)量比為LOQ至250 μg/kg，其峰面積與質(zhì)量比均呈良好的線性關(guān)系。線性范圍、線性回歸方程及決定系數(shù)（R2）見表1。

2.2色譜圖

色譜圖見圖3、圖4，在UPLC-FLD檢測條件下，甲砜霉素在鴿蛋和鵪鶉蛋中與雜質(zhì)實現(xiàn)了較好的分離，峰形對稱且保留時間在1.50 min左右，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖目標(biāo)化合物的保留時間接近。

2.3添加回收率、精密度、檢測限與定量限

空白鴿蛋和鵪鶉蛋中添加甲砜霉素質(zhì)量比在LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL水平時，甲砜霉素添加回收率及精密度見表2。由表2可知，甲砜霉素在鴿蛋和鵪鶉蛋中添加質(zhì)量比為LOQ至2.0 MRL時，甲砜霉素在鴿蛋和鵪鶉蛋中的添加回收率分別為83.23%～95.72%和84.37%～97.12%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.75%～3.87%和1.99%～3.70%，日內(nèi)RSD分別為2.78%～4.32%和2.74%～3.91%，日間RSD分別為3.36%～5.22%和3.44%～4.98%。經(jīng)過添加回收試驗可得，鴿蛋和鵪鶉蛋中甲砜霉素的LOD分別為3.4 μg/kg、3.3 μg/kg，LOQ分別為9.9 μg/kg、9.7 μg/kg。結(jié)果表明，此方法靈敏度高，完全滿足鵪鶉蛋和鴿蛋中甲砜霉素殘留檢測的要求，符合中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、歐盟、美國甲砜霉素殘留檢測的規(guī)定[1-3]。

2.4最佳提取方法

本研究比較了超聲提取、渦旋震蕩提取、渦旋震蕩+超聲提取和ASE提取對鴿蛋和鵪鶉蛋中甲砜霉素提取效果的影響，結(jié)果見表3。在超聲和渦旋震蕩條件下，TAP的回收率較低，雖然利用超聲結(jié)合渦旋震蕩的方法提取的回收率與ASE法提取的回收率接近，但ASE法提取后不需要再結(jié)合SPE柱進(jìn)行凈化，減少了操作帶來的誤差的同時，也縮短了前處理所用的時間。此外，本研究中還對不同比例提取劑進(jìn)行了效果對比，結(jié)果見表4，由表4可發(fā)現(xiàn)，提取劑選擇乙腈∶氨水（98∶2，體積比）時效果最佳，目標(biāo)物的回收率均在92.0%以上。最后試驗對ASE提取方法的溫度和提取時間進(jìn)行了優(yōu)化，分別比較了40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃溫度下，2 min、3 min、5 min、8 min時TAP的回收率，最終發(fā)現(xiàn)在80 ℃，5 min時為最佳的萃取條件，可獲得最佳的效果。

3討論

3.1樣品前處理方法的優(yōu)化

在研究過程中，樣品的前處理對試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性有著很大的影響。Xie等[16]以乙酸乙酯∶乙腈∶氫氧化銨（49∶49∶2，體積比）作為提取劑，利用液液萃取的方法提取雞蛋中的TAP、氟苯尼考（FF）和氟苯尼考胺（FFA），經(jīng)己烷脫脂后，用反相高效液相色譜-熒光檢測法檢測，TAP回收率在86.4%以上;Alechagaee等[17]采用固相萃取的方法，在甲醇與乙酸-乙酸銨緩沖液（5 mmol/mol，pH 5）色譜柱條件下提取動物源食品中的TAP、氟苯尼考（FF）和氟苯尼考胺（FFA），再通過UPLC-MS/MS檢測法檢測分析，也獲得了較好的檢測效果。

3.2UPLC-FLD檢測條件的優(yōu)化

在色譜法檢測中，色譜柱與流動相的選擇是影響檢測結(jié)果的重要因素。Evaggelopoulou等[18]、Zhang等[19]以及Sichilongo等[20]檢測動物源食品中氯霉素類藥物殘留時都利用了C18色譜柱，均獲得了較好的檢測效果。因此本試驗中也采用了ACQUITY UPLCR BEH C18 （2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）柱。本研究在謝愷舟等[21]利用高效液相色譜熒光檢測法檢測雞蛋中甲砜霉素殘留量的基礎(chǔ)上，比較了1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L十二烷基硫酸鈉，0 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L NaH2PO4，0.01%、0.03%、0.05%和0.10%三乙胺用量和不同pH值對目標(biāo)化合物所產(chǎn)生的影響，并對流動相進(jìn)行優(yōu)化。通過對比得出，以乙腈為流動相A，以內(nèi)含5 mmol/L磷酸二氫鈉、3 mmol/L十二烷基硫酸鈉和0.05%的三乙胺水溶液（調(diào)pH為5.3±0.1）作為流動相B（A∶B=36∶64，體積比），TAP的色譜峰與雜質(zhì)峰達(dá)到很好的分離。同時進(jìn)一步優(yōu)化目標(biāo)物質(zhì)的檢測波長，最終選擇了激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長284 nm，在此條件下既達(dá)到了目標(biāo)物的高響應(yīng)值，又無雜質(zhì)的干擾。

3.3UPLC-FLD法的突出優(yōu)勢

UPLC是在HPLC的理論及原理基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個新興的領(lǐng)域，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC采用了更短的色譜柱和更高的流速，使得分離效果更突出。在同樣條件下，UPLC能分離的色譜峰比HPLC多出一倍以上，得出的圖譜也更精確。同時，UPLC能以較快的速度或較好的分辨率完成對特征分析的高通量庫篩選，而這兩點都能使分離效率得到提高，效率的提高進(jìn)一步提高了靈敏度。總體而言，UPLC突破了普通HPLC的極限，在相同條件下，UPLC的速度、靈敏度及分離度更高，它縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量，降低了分析成本，結(jié)合檢測精度更高的FLD檢測器，使得研究結(jié)果更加精確。為這種分離技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了可能。

本試驗首次建立了ASE-UPLC-FLD方法，檢測鵪鶉蛋和鴿蛋中TAP的殘留量，為動物源食品中TAP的殘留檢測提供了新的技術(shù)方法。該檢測方法簡便、快速、高效，檢測結(jié)果滿足美國、歐盟和中國對動物性食品中甲砜霉素殘留檢測的要求。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）