羅文山，趙凌昆，劉婷婷， 張秀利*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；3.吉林省軍隊(duì)離退休干部療養(yǎng)中心，吉林 長(zhǎng)春130033)

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的一種病理類型，約占所有腎細(xì)胞癌的80%-90%[1]。目前臨床上常用TNM分期和Fuhrman核分級(jí)對(duì)ccRCC的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)[2]，但相似的TNM分期或Fuhrman核分級(jí)的病人也可能有著不同的預(yù)后[3]，這顯然不符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的要求。目前也尚無(wú)一種理想的預(yù)測(cè)ccRCC的標(biāo)志物。Cripto-1也稱作畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子-1(TDGF-1)[4]，是糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)家族的一員[5,6]。目前研究結(jié)果表明，Cripto-1在胃癌[7]、乳腺癌[8]、食管鱗癌[9]等惡性腫瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度成正比，與患者生存成反比。Klauzinska等人[10]的研究結(jié)果提示Cripto-1可能參與了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。本研究旨在觀察Cripto-1在ccRCC中的表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)分析其對(duì)預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科2014年1月至2016年12月期間，腎透明細(xì)胞癌根治術(shù)標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本共76對(duì)。年齡38—82歲，平均年齡(59.3±9.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非囊性的散發(fā)病灶；(2)術(shù)后病理證實(shí)為ccRCC；(3)臨床資料完整，完成定期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)雙側(cè)病灶；(2)合并其它惡性腫瘤；(3)曾接受過(guò)化療、靶向治療、免疫治療、中醫(yī)治療等抗腫瘤治療；(4)圍術(shù)期發(fā)生死亡。病理分期采用TNM分期(2010年AJCC發(fā)布)，并根據(jù)Fuhrman核分級(jí)進(jìn)行分級(jí)。本次研究通過(guò)佳木斯大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞系及試劑人ccRCC細(xì)胞系786-O與Caki-1，人腎上皮細(xì)胞系293T均購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。其中786-O和Caki-1用10%胎牛血清(FBS)、0.2%雙抗青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，293T用10%胎牛血清、0.2%雙抗青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件為恒溫37℃，恒定濕度，5%濃度的CO2。培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibico公司；Trizol購(gòu)自Thermol公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購(gòu)自谷歌生物技術(shù)有限公司；兔抗人Cripto-1單克隆抗體、β-actin單克隆抗體、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，免疫組化試劑盒均購(gòu)自CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法免疫組化染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，根據(jù)染色強(qiáng)度和結(jié)合程度綜合評(píng)分判定結(jié)果：無(wú)染色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，黃褐色(3分)；陽(yáng)性細(xì)胞<5%(0分)，5%-25%(1分)，26%-50%(2分)，>50%(3分)。將染色程度和陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量得分相乘，≥6分為陽(yáng)性表達(dá)，<6分為陰性表達(dá)。應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用shRNA對(duì)Cripto-1基因表達(dá)進(jìn)行敲降。應(yīng)用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

1.4 復(fù)查與隨訪方法術(shù)后24個(gè)月內(nèi)，每3個(gè)月復(fù)查1次；第3年起，每6個(gè)月復(fù)查一次。復(fù)查內(nèi)容包括血清腫瘤標(biāo)志物檢查、胸腹盆腔CT等。所有患者均實(shí)行門診或電話隨訪，結(jié)合相關(guān)護(hù)理情況。終止時(shí)間定義為經(jīng)病理學(xué)診斷為復(fù)發(fā)、因腫瘤死亡，或隨訪滿60個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS(Ver 19.0 IBM，NY)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本次研究所有數(shù)據(jù)結(jié)果均經(jīng)過(guò)三次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。分類變量應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用Studentt檢驗(yàn)，生存曲線應(yīng)用Kaplan-Meier方法繪制，并應(yīng)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估差異。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 Cripto-1在腫瘤組織和正常腎組織中的表達(dá)情況對(duì)腫瘤組織和正常腎組織Cripto-1進(jìn)行免疫組化染色，可以發(fā)現(xiàn)，Cripto-1主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。Cripto-1在腫瘤組織中，無(wú)論是蛋白水平，還是mRNA水平的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

a.在正常腎組織中陰性表達(dá)；b.在腫瘤組織中弱表達(dá)；c.在腫瘤組織中強(qiáng)表達(dá)；d.兩種組織中Cripto-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；e.Cripto-1蛋白在兩種組織中的表達(dá)情況

2.2 Cripto-1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系根據(jù)Cripto-1的表達(dá)對(duì)患者進(jìn)行分組，76例病人中，Cripto-1高表達(dá)49例，低表達(dá)27例。Cripto-1的表達(dá)與T分期、N分期、TNM分期相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡和Fuhrman核分級(jí)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 Cripto-1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Cripto-1高表達(dá)組的患者5年無(wú)病生存率(DFS)和總體生存率(OS)均顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 Cripto-1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響為了觀察Cripto-1對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，利用shRNA對(duì)786-O與Caki-1兩株細(xì)胞系的Cripto-1進(jìn)行敲降，構(gòu)建Cripto-1低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。并檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在敲降Cripto-1之后，細(xì)胞的增殖活性、遷移能力和侵襲能力均發(fā)生不同程度的降低。見(jiàn)圖3。

表1 Cripto-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

a.兩組總生存率比較；b.兩組無(wú)病生存率比較

3 討論

Cripto-1屬于表皮生長(zhǎng)因子-富半胱氨酸(EGF-CFC)家族，目前發(fā)表的研究結(jié)果大部分認(rèn)為，其作為發(fā)揮調(diào)解細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育功能的蛋白，主要在胚胎早期表達(dá)，同時(shí)，當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，或形成腫瘤時(shí)，Cripto-1也出現(xiàn)高表達(dá)，并且在多項(xiàng)研究中已經(jīng)證實(shí)，其可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，提高腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力[11-13]。另外，也有研究者認(rèn)為其可能與腫瘤預(yù)后有關(guān)[14,15]。Cripto-1是否在腎透明細(xì)胞癌中也發(fā)揮著同樣的作用，目前相關(guān)研究較少。

本研究對(duì)76對(duì)ccRCC腫瘤組織和正常組織進(jìn)行了免疫組化染色，并提取組織中RNA和蛋白，行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在ccRCC組織中，無(wú)論是mRNA還是蛋白水平，Cripto-1的表達(dá)均顯著升高。這提示Cripto-1在ccRCC的惡性進(jìn)展中，可能也起到了一定的作用[16,17]。而Cripto-1并不是完全在正常組織中不表達(dá)，在IHC結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)有部分正常腎組織也表現(xiàn)為Cripto-1弱陽(yáng)性表達(dá)，回顧這些病例，發(fā)現(xiàn)大多為分期較晚的患者，這種現(xiàn)象可以用“區(qū)域性癌化”來(lái)揭示，即腫瘤的發(fā)生是一個(gè)累積的過(guò)程，遺傳物質(zhì)在逐步發(fā)生改變，正常組織在轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒园┙M織之前，已經(jīng)開(kāi)始呈現(xiàn)了一種“癌前”的狀態(tài)，這種形態(tài)下的細(xì)胞，形態(tài)學(xué)上是正常的，但是遺傳物質(zhì)可能已經(jīng)發(fā)生了改變。這也提示Cripto-1是否可以作為一個(gè)標(biāo)志物，去鑒別形態(tài)學(xué)正常的細(xì)胞，是否即將發(fā)生惡性改變，這個(gè)問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。

(A-D)786-O與Caki-1細(xì)胞系在敲降Cripto-1后增殖能力的變化；(E-F)Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證786-O與Caki-1細(xì)胞系在敲降Cripto-1后遷移能力的變化；(G-H)劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證786-O與Caki-1細(xì)胞系在敲降Cripto-1后侵襲能力的變化

根據(jù)IHC的結(jié)果，將患者分為Cripto-1高表達(dá)組和低表達(dá)組，并對(duì)臨床病理資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cripto-1高表達(dá)組的患者，腫瘤惡性程度更高，Cripto-1高表達(dá)組有23例(46.94%)患者為T3-T4期，28例患者(57.14%)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，22例患者(44.90%)的TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期，這些都顯著高于Cripto-1低表達(dá)組(P<0.05)。而進(jìn)一步對(duì)患者進(jìn)行隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cripto-1高表達(dá)組的患者，無(wú)論是5年無(wú)病生存率還是總生存率，均較Cripto-1低表達(dá)組的患者要差(P<0.05)。本研究又用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了原因的探索，選擇了本身Cripto-1表達(dá)較高的786-O和Caki-1細(xì)胞系，并應(yīng)用shRNA對(duì)Cripto-1進(jìn)行了敲降(Knockdown)，并進(jìn)行了一系列的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在敲降了Cripto-1之后，兩種細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力都受到了顯著的影響，具體表現(xiàn)為增殖速度下降、遷移和侵襲的能力下降。這提示Cripto-1的高表達(dá)，會(huì)提高腫瘤細(xì)胞的惡性潛能，使其增殖速度更快、遷移和侵襲能力更強(qiáng)，相應(yīng)的，腫瘤發(fā)展更快，且更容易發(fā)生術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這也就解釋了Cripto-1高表達(dá)的患者預(yù)后更差的原因。這也同時(shí)提示Cripto-1可能作為一個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)ccRCC進(jìn)行靶向的治療。

本研究的局限之處在于，這是一項(xiàng)單中心的回顧性研究，且樣本量較小，可以增加中心，擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步對(duì)本研究的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。另外，本研究?jī)H進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)的研究，并未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而腫瘤所處的微環(huán)境對(duì)于腫瘤的發(fā)展也至關(guān)重要。目前有研究認(rèn)為Cripto-1可以激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路[18]，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但本研究并未對(duì)該通路的標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，未來(lái)會(huì)進(jìn)行相關(guān)機(jī)制方面的探索。

綜上，Cripto-1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)升高，可以作為判斷預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)也可能成為治療ccRCC的新靶點(diǎn)。