譚莎莎，馬方勵(lì)，崔樹茂*，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州， 510623)

羅伊氏乳桿菌是目前報(bào)道的可存在于所有脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的乳酸桿菌[1-2]，它能夠很好地黏附在腸黏膜上，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高免疫力,促進(jìn)人體健康[2]。乳酸菌通常采用真空冷凍干燥進(jìn)行制備。真空冷凍干燥是將被干燥物料中的水凍結(jié)成冰，然后使冰升華而除去水的一種干燥方法[3]，其基本原理是在低溫低壓下傳熱傳質(zhì)[4]。但是菌體在冷凍干燥過程中會(huì)有損傷，主要包括機(jī)械損傷和溶質(zhì)損傷。機(jī)械損傷是由于低溫時(shí)細(xì)胞內(nèi)外冰晶生長(zhǎng)產(chǎn)生的機(jī)械力量導(dǎo)致的。溶質(zhì)損傷則是由于凍結(jié)過程中細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，電解質(zhì)的濃度明顯增大造成的，進(jìn)而增加了細(xì)胞死亡的可能性[5-6]。因此在冷凍干燥過程中需要加入凍干保護(hù)劑來提高凍干后活菌數(shù)。

最常使用的保護(hù)劑有糖類、蛋白質(zhì)、聚合物等，這些不同分子質(zhì)量的保護(hù)劑以不同的途徑保護(hù)著菌體，例如低聚糖等通過穿過細(xì)胞壁但不穿過細(xì)胞質(zhì)膜的方式保護(hù)著菌體，甘油等通過穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的方式保護(hù)著菌體，蛋白質(zhì)等能在菌體表面形成蛋白膜，避免菌體暴露于外界環(huán)境中遭到損傷[7-8]；另外，還有其他一些物質(zhì)可能會(huì)加強(qiáng)凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果。抗氧化物質(zhì)能降低保護(hù)劑的氧化還原電位, 并消耗試驗(yàn)過程中的部分氧氣[9]；無機(jī)鹽類能滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而使胞內(nèi)電解質(zhì)溶液的濃度升高，進(jìn)而減少溶質(zhì)損傷[10]；氨基酸能作為pH調(diào)節(jié)劑以防止因pH變化導(dǎo)致的大分子物質(zhì)變性[11]；GSH能維持細(xì)胞膜的較高的不飽和度比和飽和脂肪酸的短鏈長(zhǎng)度，從而獲得完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[12]；谷氨酸鈉能與水密切作用使干粉保留適量的水分，滿足微生物維持生命的最低需求[13]；甜菜堿則能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和離子平衡[14]。通常認(rèn)為不同保護(hù)原理的保護(hù)劑復(fù)合后會(huì)提高菌體的凍干存活率，因此目前乳酸菌的冷凍干燥配方一般混合了多種保護(hù)劑即復(fù)合保護(hù)劑。但不同乳酸菌的凍干保護(hù)研究參差不齊，無規(guī)律可循。本文系統(tǒng)研究所有類保護(hù)劑，總結(jié)規(guī)律為乳酸菌凍干保護(hù)劑的選擇提供明確且簡(jiǎn)便的方法。

真空冷凍干燥是一個(gè)高能耗過程，如何降低乳酸菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的能耗也是凍干研究的重要目標(biāo)。現(xiàn)代工業(yè)中，乳酸菌凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量(即凍干結(jié)束干粉得率)通常在15%～20%。提高凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，可減少菌懸液的體積，從而降低凍干機(jī)的使用面積，降低能耗。本文將在得到最優(yōu)保護(hù)劑的基礎(chǔ)上優(yōu)化凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，實(shí)現(xiàn)高密度凍干，減少凍干機(jī)的使用面積以實(shí)現(xiàn)降低凍干能耗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌138-1 (Lactobacillusreuteri138-1)(CCFM8631)，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)所用的MRS培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巖藻糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、水蘇糖、山梨糖醇、甘油、赤蘚糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、抗性糊精、乳清蛋白、膠原蛋白、脫脂乳、谷氨酸鈉、甜菜堿、硫酸錳、硫酸鈉、谷胱甘肽、抗壞血酸等，創(chuàng)賽生物科技有限公司；復(fù)合維生素，惠氏制藥有限公司；復(fù)合核苷酸(A、C、T、G)，山西萊克生物科技有限公司；腺嘌呤(A)，購自南京鑫越源生物科技有限公司；味之素(I+G)，興化市味之素食品配料有限公司；胰蛋白胨，鄭州盛仁堂生物科技有限公司；大豆蛋白胨，安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái)，上海智誠分析儀器制造有限公司；泰事達(dá)凍干機(jī)，西班牙Telstar公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

將置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解凍。用接種環(huán)沾取菌液后在MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。用接種環(huán)從平板上長(zhǎng)出的菌落中挑取單菌落，將其接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取200 μL再次接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后得到活化后的種子液。

1.3.2 羅伊氏乳桿菌的凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清。將菌泥與水按質(zhì)量比1∶1混勻后調(diào)pH至6.5左右，再將菌懸液以體積比2∶1與保護(hù)劑溶液混合，充分均勻后取1 mL分裝至凍干瓶?jī)龈伞?/p>

凍干工藝：預(yù)凍，控制層板1 h內(nèi)降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.3 保護(hù)劑溶液的配制

(1)不同種類保護(hù)劑

分別準(zhǔn)確稱取糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類等各類保護(hù)劑20 g，溶解后用蒸餾水定容至100 mL，即保護(hù)劑溶液質(zhì)量濃度為200 g/L。

(2)不同分子量保護(hù)劑的復(fù)配

保護(hù)劑A(質(zhì)量比1∶1復(fù)配)：復(fù)合保護(hù)劑以兩種保護(hù)劑復(fù)配且兩者之間1∶1復(fù)配，即各100 g/L。

保護(hù)劑B(不同質(zhì)量比復(fù)配)：m(低聚異麥芽糖)：m水蘇糖=1∶2時(shí)，低聚異麥芽糖70 g/L，水蘇糖140 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=2∶1時(shí)，低聚異麥芽糖140 g/L,水蘇糖70 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=1∶3時(shí)，低聚異麥芽糖50 g/L,水蘇糖150 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=3∶1時(shí)，低聚異麥芽糖150 g/L,水蘇糖50 g/L。

(3)優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑復(fù)配其他類保護(hù)劑

低聚異麥芽糖120 g/L,水蘇糖60 g/L,其他類保護(hù)劑30 g/L。

糖類保護(hù)劑在115℃條件下滅菌20 min，蛋白質(zhì)和聚合物類保護(hù)劑在85℃條件下滅菌30 min。

1.3.4 羅伊氏乳桿菌的高密度凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清，收集菌泥。選取優(yōu)化后的凍干保護(hù)劑配方配制保護(hù)劑，將菌泥干物質(zhì)和保護(hù)劑干物質(zhì)以質(zhì)量比1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%、17%、23%和29%的凍干體系，分別取1 mL分裝至凍干瓶?jī)龈?。凍干工藝?.3.2。

1.3.5 凍干存活率的測(cè)定[15]

將凍干后的菌劑用無菌蒸餾水還原到凍干前的質(zhì)量，混勻后測(cè)定其中的菌落總數(shù)凍干存活率如公式(1)所示：

(1)

式中：活菌數(shù)的單位為CFU/mL。

1.3.6 凍干前后樣品的活菌計(jì)數(shù)

采用活菌計(jì)數(shù)法[16]，取0.5 mL菌液以10倍依次遞增稀釋至3個(gè)合適稀釋度，各取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，將已溶化并冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基傾注15 mL至培養(yǎng)皿中，立即放在桌上手動(dòng)搖晃混勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h取出并記錄活菌數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)值的測(cè)定均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，在后期的統(tǒng)計(jì)分析中不再重復(fù)強(qiáng)調(diào)。不同組(>3)之間的顯著性差異通過進(jìn)行ANOVA進(jìn)行判斷(Tukey’s檢驗(yàn))，兩組之間的顯著性差異通過t檢驗(yàn)進(jìn)行判斷(SPSS 16.0軟件)，P<0.05則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類凍干保護(hù)劑的保護(hù)特性

羅伊氏乳桿菌在不同種類保護(hù)劑中的凍干存活率如表1所示。

表1 羅伊氏乳桿菌在不同種類保護(hù)劑中的凍干存活率Table 1 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different types of protective agents

注：表中不同字母代表顯著性(P<0.05)；a～o代表凍干存活率大～小

目前最常用的保護(hù)劑有糖(醇)類、蛋白質(zhì)類以及聚合物類。糖(醇)類保護(hù)劑具有多個(gè)羥基，可替代水分子在冷凍干燥過程中與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，避免細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性受到破壞[5,17]；蛋白質(zhì)類的保護(hù)劑能在菌體表面形成蛋白膜，穩(wěn)定菌體細(xì)胞膜，為菌體提供了保護(hù)衣，保護(hù)菌體不因暴露于外界環(huán)境中而受到損傷[8，18]。它也為凍干的菌體提供了疏松、多孔的結(jié)構(gòu)[19-20]；聚合物類保護(hù)劑則可以顯著提高生物制品混合溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制冷凍干燥過程中pH值的劇烈變化等。通常認(rèn)為不同保護(hù)原理的凍干保護(hù)劑復(fù)合提高菌體的凍干存活率，這也為下面開展不同分子量的凍干保護(hù)劑復(fù)配奠定了基礎(chǔ)。

為了系統(tǒng)探究這些糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類保護(hù)劑對(duì)乳桿菌的凍干保護(hù)效果，將文獻(xiàn)報(bào)道過的糖(醇)類、蛋白質(zhì)類、聚合物類保護(hù)劑進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，由表1可知，37種不同保護(hù)劑中大部分的保護(hù)效果均顯著高于無菌水的對(duì)照樣(P<0.05)，低聚糖的凍干保護(hù)效果最好，羅伊氏乳桿菌138-1在不同低聚糖保護(hù)下的凍干存活率均達(dá)到60%左右。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知不能滲透進(jìn)細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)和聚合物的凍干保護(hù)效果不好，這可能是由于大分子保護(hù)劑是通過“包裹”的形式保護(hù)菌體的，所以不能像有些糖(醇)類保護(hù)劑那樣可以滲透進(jìn)細(xì)胞壁，在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間形成一層糖(醇)溶液保護(hù)層，保護(hù)細(xì)胞膜的功能和完整性。而通常認(rèn)為的可滲透進(jìn)細(xì)胞膜的赤蘚糖醇、甘油的凍干保護(hù)效果也不好，充分說明乳桿菌的凍干過程細(xì)胞膜的保護(hù)是關(guān)鍵因素。不同分子量的糖(醇)類物質(zhì)隨著分子量的增大，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高，更有利于菌體的凍干存活。因此相同濃度下低聚糖較單糖表現(xiàn)出更優(yōu)的保護(hù)效果。

2.2 不同分子質(zhì)量的凍干保護(hù)劑復(fù)配對(duì)菌體的影響

2.2.1 不同分子質(zhì)量保護(hù)劑以質(zhì)量比1∶1復(fù)配對(duì)菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同分子量變合保護(hù)劑中的凍干存活率如表2所示。

表2 羅伊氏乳桿菌在不同分子量復(fù)合保護(hù)劑中的凍干存活率Table 2 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different molecular weight complex protective agents

注：*代表與低聚異麥芽糖相比的顯著性，*代表P<0.05，**代表P<0.01，****代表P<0.000 1(下同)

通過分析不同種類的凍干保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌的凍干保護(hù)作用，證實(shí)了大小分子對(duì)其保護(hù)方式是不一樣的。那么單一保護(hù)劑與復(fù)合保護(hù)劑是否具有相同的凍干保護(hù)效果呢？焦琳等[21]在優(yōu)化嗜熱鏈球菌M5-5菌體細(xì)胞的凍干保護(hù)劑時(shí)選取了3種保護(hù)劑，包含小分子保護(hù)劑海藻糖、甘油和大分子保護(hù)劑：脫脂乳。發(fā)現(xiàn)海藻糖、甘油和脫脂乳作為單一凍干保護(hù)劑時(shí)，菌體細(xì)胞存活率最高為47.51%，但應(yīng)用通過正交試驗(yàn)確定的大小分子復(fù)合保護(hù)劑配方后菌體的凍干存活率可達(dá)88.41%，提高了2倍左右。袁亞宏和韓德權(quán)等[22-23]對(duì)保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌的凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化也得出了相似結(jié)論。這些都證明了單一的保護(hù)劑并不能滿足冷凍干燥和菌體抵抗外界惡劣條件的要求，所以一般都是按一定配方混合使用。

因此選取不同分子質(zhì)量的保護(hù)劑，大分子(抗性糊精)、低聚糖(低聚異麥芽糖、水蘇糖)和小分子糖(海藻糖、乳糖)兩兩復(fù)配進(jìn)行羅伊氏乳桿菌138-1的凍干。復(fù)配后的組別較單一低聚異麥芽糖組沒有顯著性提高，并不和大部分文獻(xiàn)中提出的觀點(diǎn)相同，多種保護(hù)劑混合運(yùn)用效果更好，而且發(fā)現(xiàn)如果復(fù)配一個(gè)效果不好的保護(hù)劑反而會(huì)降低保護(hù)效果。低聚糖和不同低聚糖的復(fù)配依然呈現(xiàn)出最好的凍干保護(hù)效果。

2.2.2 不同低聚糖以不同比例復(fù)配對(duì)菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同低聚復(fù)合保護(hù)劑中的凍干存活率如表3所示。

表3 羅伊氏乳桿菌在不同低聚糖復(fù)合保護(hù)劑中的凍干存活率Table 3 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteriin different molecular weight complex protective agents

注：無顯著性差異(P>0.05)

多數(shù)研究表明，復(fù)合保護(hù)劑因具有不同特性的保護(hù)劑，一般情況下按一定比例混合使用后可明顯提高凍干保護(hù)效果[24]。但由表3可知，分別將2種低聚糖之間的質(zhì)量比調(diào)整為1∶2、2∶1、1∶3以及3∶1，凍干存活率之間的差異性并不明顯，為60%左右。由此可知道，不同低聚糖以不同比例復(fù)配，不影響整體凍干效果。這也進(jìn)一步證實(shí)了低聚糖作為凍干保護(hù)劑的優(yōu)勢(shì)假設(shè)。

2.3 優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑復(fù)配其他類物質(zhì)對(duì)菌體凍干存活的影響

正如前言所述，凍干保護(hù)劑最常用的為糖類、聚合物、蛋白質(zhì)等，但還有其他一些可能加強(qiáng)凍干保護(hù)效果的物質(zhì)，這些物質(zhì)以不同的原理對(duì)菌體有一定的保護(hù)效果。羅伊氏乳桿菌在優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑復(fù)配其他類物質(zhì)中的凍干存活率如表4所示。將這些可能加強(qiáng)凍干保護(hù)效果的物質(zhì)與低聚糖復(fù)配之后，可以發(fā)現(xiàn)有的組別的凍干存活率有所提高，但并不顯著。保護(hù)效果最好的組合為低聚異麥芽糖+水蘇糖+復(fù)合核苷酸(I、G)，凍干存活率為(66.44±2.46)%。而且依舊發(fā)現(xiàn)復(fù)合保護(hù)劑的保護(hù)效果較單一保護(hù)劑的保護(hù)效果沒有顯著性的提高。由此可知，低聚糖的凍干保護(hù)效果較好，復(fù)配其他已有文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)菌凍干保護(hù)起積極作用的物質(zhì)未表現(xiàn)出凍干保護(hù)效果的提升。

表4 羅伊氏乳桿菌在優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑復(fù)配其他類物質(zhì)中的凍干存活率Table 4 Freeze-drying survival rate of Lactobacillusreuteri in other protective substances

2.4 菌株的高密度凍干

冷凍干燥需要的時(shí)間較長(zhǎng)，通常乳酸菌的凍干需要72 h左右，這使得凍干菌制劑的成本高，發(fā)展受到限制。另外，在全球能源緊缺的今天，節(jié)能降耗亦成為工業(yè)發(fā)展中不可忽視的問題。然而，凍干制品具有多重優(yōu)越性，所以降低乳酸菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的能耗成為凍干研究的熱點(diǎn)之一。提高凍干前菌懸液的干物質(zhì)含量，可減少菌懸液的體積，降低凍干機(jī)的使用面積和能耗。

羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率如表5所示。由表5可知，m(菌泥干物質(zhì))∶m(保護(hù)劑干物質(zhì))為1∶1.2時(shí)效果最好，凍干存活率普遍達(dá)到90%左右。也就是說凍干樣品中保護(hù)劑干物質(zhì)比菌泥干物質(zhì)多時(shí)，才能達(dá)到較好的保護(hù)效果?，F(xiàn)在工業(yè)上普遍采用15%～20%的總干物質(zhì)含量，本次實(shí)驗(yàn)將總干物質(zhì)含量提高到了30%左右，不僅使得能耗大大降低，存活率也保持在了90%以上。制得羅伊氏138-1凍干菌粉活菌含量2 500億/g(2.5×1011CFU/g)。

表5 羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率Table 5 Survival rate of Lactobacillus reuteri underhigh-density freeze-drying

3 結(jié)論

(1)低聚糖較單糖(醇)、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物對(duì)羅伊氏乳桿菌具有更好的凍干保護(hù)效果，且不同的低聚糖之間無顯著性差異。

(2)不同分子質(zhì)量保護(hù)劑復(fù)配后凍干保護(hù)效果未顯著提升，且復(fù)配保護(hù)效果差的保護(hù)劑后凍干保護(hù)效果反而降低；低聚異麥芽糖和水蘇糖兩種低聚糖的復(fù)合與單一低聚糖做保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果無顯著差異，且改變兩者的復(fù)配比例后凍干保護(hù)效果亦無顯著差異。

(3)低聚糖復(fù)配已有文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)菌凍干保護(hù)起積極作用的物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、抗氧化劑、緩沖劑、核苷酸等，未表現(xiàn)出凍干保護(hù)效果的提升。

(4)保護(hù)劑干物質(zhì)量高于菌泥干物質(zhì)量時(shí)，提高菌體的凍干存活率。菌泥與保護(hù)劑干物質(zhì)的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1.2，凍干前菌懸液的干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可提高至30%左右，凍干存活率達(dá)93.02%。降低了凍干體積，提高了凍干效率。