郭佳欣，張培基，劉丁玉，洪坤強(qiáng)，陳濤，王智文*

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津, 300350)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津, 300350)3(合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津, 300350)4(天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺(tái)，天津, 300350)

核黃素是一種與生物生長緊密相關(guān)的物質(zhì)，參與細(xì)胞的氧化還原和新陳代謝，與核酸、蛋白質(zhì)以及脂肪的代謝有關(guān)，維護(hù)細(xì)胞功能的正常運(yùn)行[1-2]。在醫(yī)藥與飼料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[3-7]。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP) 誘變技術(shù)作為一種近年來新興的高效誘變手段，具有突變譜廣、安全性高、操作快速簡單、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[8]。該方法在工業(yè)誘變育種中具有極大的應(yīng)用潛力，ARTP誘變已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種細(xì)菌和真菌，還應(yīng)用在植物、藻類上，在促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞生物量的生產(chǎn)，提高酶活性，提高各種化學(xué)品產(chǎn)量等方面均有成功展示[9]。

誘變選育是提高核黃素產(chǎn)量的有效策略，但經(jīng)過多輪突變和篩選后產(chǎn)量會(huì)達(dá)到瓶頸[10]。為了獲得更具有工業(yè)競爭力的核黃素高產(chǎn)菌，除了人工誘變外，代謝工程選育高產(chǎn)菌株也是重要的發(fā)展方向。最近，SHI等[11]通過過表達(dá)核黃素操縱子，解調(diào)嘌呤合成途徑轉(zhuǎn)錄水平和解除關(guān)鍵酶反饋抑制作用，改善嘌呤核苷酸的供應(yīng)，得到了1株核黃素高產(chǎn)菌，產(chǎn)量較出發(fā)菌提升了3倍。BUEY等[12]通過過表達(dá)核苷酸生物合成的關(guān)鍵酶IMP脫氫酶，促進(jìn)GTP的積累，使1株棉囊阿舒氏酵母菌的核黃素產(chǎn)量提升了40%。

本科研組前期通過隨機(jī)誘變、基因組重排和代謝工程等手段構(gòu)建了一系列核黃素突變菌株，但是突變株存在生長緩慢、菌體濃度低、遺傳背景不清晰以及遺傳操作困難等問題。WANG等對(duì)B.subtilis24進(jìn)行了全基因組測序和逆向代謝工程重構(gòu)了1株遺傳背景清晰的重構(gòu)菌枯草芽孢桿菌BS120，核黃素產(chǎn)量達(dá)到(1.85±0.03) g/L[13]。本研究進(jìn)一步對(duì)BS120進(jìn)行ARTP等離子誘變，篩選遺傳穩(wěn)定的核黃素高產(chǎn)突變菌株，為探討核黃素高產(chǎn)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株或質(zhì)粒

核黃素生產(chǎn)菌BS120、核黃素操縱子質(zhì)粒pMX45，保藏于天津大學(xué)代謝工程與系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

Spizizen基本培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 8，(NH4)2SO40.2，KH2PO41.31，Na2HPO40.6，MgSO4·7H2O 0.2，檸檬酸三鈉二水 0.25，谷氨酰胺 2，色氨酸 0.05，VB1溶液 0.01，1 000×微量元素溶液 1 mL。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5和NaCl 10，pH 7.0。固體培養(yǎng)基加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂。

96深孔板篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40，酵母粉 8，尿素 2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 100，酵母粉 20，尿素 2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.5，pH=7.0。

基本鹽培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40，(NH4)2SO42，KH2PO413.1，Na2HPO46，檸檬酸三鈉二水1.2，MgSO4·7H2O 2.5，色氨酸0.05，1 000×微量元素500 μL。

1.1.3 主要試劑

酵母粉 YP601，安琪酵母股份有限公司；寡霉素、8-氮鳥嘌呤，大連美侖生物技術(shù)有限公司；D-(+)-葡萄糖，上海生工生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、紅霉素，BBI生命科學(xué)有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

ARTP-IIS誘變系統(tǒng)，北京思清源有限公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器公司；MULTIPLEX1R32R大型離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；BIOMETRAPCR儀，Tpersonal。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ARTP誘變

挑取單菌落至基本鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為2.0～3.0，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2次后，重懸菌體制成菌懸液備用。ARTP誘變條件為100 W、10 SLM、2 mm。吸取10 μL菌懸液均勻涂布至無菌載片上，誘變時(shí)間為20～60 s，誘變后的菌液加到4.99 mL PBS緩沖液的EP管中，振蕩混勻，取100 μL菌液涂布于Spizizen培養(yǎng)基固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)至單菌落長出。繪制致死曲線，選擇出合適的誘變時(shí)間。

致死率計(jì)算如公式(1)所示[14]為：

(1)

1.2.2 篩選拮抗物最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定

將出發(fā)菌株的菌懸液經(jīng)適度稀釋，取100 μL涂布在含有20～50 mg/L 8-氮鳥嘌呤或100～300 mg/L寡霉素的Spizizen基本鹽培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)48～72 h，以不含篩選拮抗物平板上菌體的生長狀況為對(duì)照，觀察并記錄未長出菌落的篩選拮抗物的最低濃度，即為該篩選拮抗物的MIC[15]，然后按MIC作為添加水平制作相應(yīng)的篩選拮抗物篩選平板。

1.2.3 誘變菌株的初篩和復(fù)篩

取100 μL誘變后菌液涂布于含有相應(yīng)篩選拮抗物MIC濃度的篩選平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。挑取誘變的單菌落，對(duì)點(diǎn)到Spizizen基本鹽固體平板上，37 ℃，24～48 h。初篩后，挑取核黃素產(chǎn)量顯著提高的突變單菌落接種到5 mL液體LB試管中，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，220 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，獲得一級(jí)種子。吸取適量的一級(jí)種子接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，初始OD為0.05，41 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)96～120 h，測定核黃素的產(chǎn)量、殘?zhí)牵Y選出核黃素高產(chǎn)突變菌株。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物測定

1.2.4.1 核黃素濃度的測定

本實(shí)驗(yàn)中核黃素濃度測定是通過紫外分光光度計(jì)測量OD444，有效范圍為0.3～0.8。使用0.5 mol/L NaOH溶液進(jìn)行溶解稀釋，再用乙酸-乙酸鈉溶液稀釋并中和NaOH溶液，13000 r/min離心2 min沉淀固體雜質(zhì)，測量上清液吸光度。

核黃素質(zhì)量濃度核算[16]如公式(2)所示：

(2)

1.2.4.2 殘?zhí)堑臏y定

發(fā)酵過程中葡萄糖是利用生物傳感分析儀進(jìn)行測定[16]。

1.2.5 核黃素操縱子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

本實(shí)驗(yàn)使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，即枯草芽孢桿菌的Spizizen轉(zhuǎn)化法[16]向枯草芽孢桿菌BSG3中轉(zhuǎn)化核黃素操縱子質(zhì)粒pMX45。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性分析

挑取單菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取100 μL菌液至另一支4.9 mL LB液體培養(yǎng)基試管，相同條件下重復(fù)轉(zhuǎn)接20次。根據(jù)公式計(jì)算代時(shí)得到一次轉(zhuǎn)接為6代，對(duì)第0、30、60、90、120代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定核黃素濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Origin 8.1軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳ARTP誘變時(shí)間的選擇

在誘變處理時(shí)，對(duì)出發(fā)菌株BS120進(jìn)行20、30、40、50、60 s誘變處理，并繪制致死率曲線(圖1-A)。當(dāng)照射時(shí)間為30 s時(shí)，致死率達(dá)到45.02%; 照射時(shí)間為40 s時(shí)，致死率達(dá)到了91.30%。進(jìn)一步測定35～40 s誘變后的致死率，對(duì)出發(fā)菌株BS120進(jìn)行35、36、37、38、39 s誘變處理，并繪制致死率曲線(圖1-B)。誘變的致死率約為90%時(shí)，篩選到目標(biāo)突變菌株的可能性最大[17]，所以選擇37s作為誘變時(shí)間。

A-誘變處理時(shí)間0、20、30、40、50、60 s；B-誘變處理時(shí)間35、36、37、38、39 s圖1 枯草芽孢桿菌致死曲線Fig.1 Lethal curve of Bacillus subtilis

2.2 誘變菌株的篩選與發(fā)酵驗(yàn)證

2.2.1 8-氮鳥嘌呤為拮抗物的突變株篩選

8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)作為核黃素合成途徑中核黃素前體物鳥三磷(guanosinetriposophate,GTP)的結(jié)構(gòu)類似物可以阻斷磷酸核糖焦磷酸合成酶(pho-sphoribosyl-pyrophosphate synthetase,PRPS)對(duì)GTP的反饋抑制作用[18-19]，從而大量積累GTP進(jìn)而有效促進(jìn)核黃素的合成，增加核黃素的產(chǎn)量[20-21]。

為了測定8-氮鳥嘌呤對(duì)出發(fā)菌株BS120的MIC，將BS120菌懸液稀釋至菌體濃度為1×105個(gè)/mL涂布在添加了8-氮鳥嘌呤的Spizizen培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上生長的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)(表1)。

由表1可知， 8-氮鳥嘌呤的MIC為40 mg/L。將對(duì)BS120經(jīng)ARTP誘變37 s后的菌液涂布于添加了40 mg/L 8-氮鳥嘌呤篩選平板，37 ℃，24～48 h，經(jīng)過96孔板初篩后對(duì)產(chǎn)量較高的9株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩(圖2)。其中編號(hào)為1-3-28的菌株搖瓶發(fā)酵96 h核黃素產(chǎn)量為(2 996.68±30.66) mg/L，得率為(30.52±1.18) mg/g葡萄糖，較BS120分別提高61.60%和58.12%，命名為BSG1。

表1 出發(fā)菌株BS120對(duì)8-氮鳥嘌呤敏感性Table 1 8-azaguanine resistance of BS120

注： “+++++”代表每板菌落數(shù)目超過104；“++++”代表菌落數(shù)目在103～104；“+++”代表菌落數(shù)目在102～103；“++”代表菌落數(shù)目在10～100；“+”代表菌落數(shù)目稀少，在10以內(nèi)；“-”代表無菌落生長(下同)

圖2 8-氮鳥嘌呤為拮抗物的突變株搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Screening results of 8-azaguanine mutant strains

2.2.2 寡霉素篩選誘變菌株

寡霉素(oligomycin)作為細(xì)胞氧化磷酸化酶的抑制劑[22-23]。也可以促進(jìn)呼吸鏈中黃素輔酶的需求量，進(jìn)而促進(jìn)核黃素的生物合成，提高胞內(nèi)核黃素的含量[24]。為了測定寡霉素對(duì)出發(fā)菌株BSG1的MIC，將BSG1菌懸液稀釋至菌體濃度為1×105個(gè)/mL涂布在含寡霉素的Spizizen培養(yǎng)基中，37 ℃，24 h，對(duì)平板上生長的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)(表2)。

表2 出發(fā)菌株BSG1對(duì)寡霉素敏感性Table 2 Oligomycin resistance of BSG1

由表2可知，寡霉素的MIC為300 mg/L，將誘變的菌株涂布于含有300 mg/L寡霉素篩選平板，經(jīng)過96孔板初篩后選取產(chǎn)量較高的11株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩(圖3)。其中編號(hào)為2-3-19的菌株搖瓶發(fā)酵96 h 核黃素產(chǎn)量為(3 403.76±55.96) mg/L，得率為(34.50±0.47) mg/g葡萄糖，較親株BSG1分別提升13.58%和11.54%，命名為BSG3。

圖3 寡霉素誘變菌株搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.3 Screening results of oligomycin mutant strains

2.3 核黃素操縱子的過表達(dá)提高核黃素產(chǎn)量

核黃素操縱子過表達(dá)質(zhì)粒pMX45是約28 kb的低拷貝數(shù)質(zhì)粒，包含核黃素操縱子的EcoRI 酶切染色體片段(10 kb)和18 kb的載體兩部分組成[25]。將其轉(zhuǎn)入BSG3中以期為進(jìn)一步提高核黃素產(chǎn)量，并同時(shí)對(duì)BSG5及BS120，BSG1，BSG3進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證(圖4)。

圖4 BS120，BSG1，BSG3和BSG5發(fā)酵驗(yàn)證Fig.4 Validation fermentationof BS120, BSG1, BSG3and BSG5

由圖4可知，BSG5在搖瓶發(fā)酵120 h核黃素產(chǎn)量可達(dá)到(4 467.08±99.47) mg/L，得率為(42.56±1.25) mg/g葡萄糖，較BSG3提升分別為31.24%和23.36%。質(zhì)粒pMX45的導(dǎo)入促進(jìn)核黃素產(chǎn)量得到了顯著提升。

2.4 突變菌株生長與核黃素合成能力

分別檢測了親本菌株和3株突變株的生長情況(圖5)。出發(fā)菌株BS120和BSG1，BSG3生長規(guī)律基本相同，而BSG5生長相對(duì)滯后。原因可能是導(dǎo)入的pMX45質(zhì)粒較長，造成菌株生長代謝負(fù)擔(dān)加重，菌株生長變慢。

圖5 BS120，BSG1，BSG3和BSG5生長曲線圖Fig.5 Growth curve of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5

隨后，對(duì)4株菌分別進(jìn)行發(fā)酵表征，每隔12 h測定核黃素及殘?zhí)?圖6)。

圖6 BS120， BSG1， BSG3和BSG5發(fā)酵表征對(duì)比圖Fig.6 Fermentation characterization of BS120, BSG1,BSG3 and BSG5

由圖6可知，在基本鹽培養(yǎng)基中，發(fā)酵到60 h時(shí)，4株菌株均基本停止耗糖。BSG5核黃素產(chǎn)量和得率達(dá)到(258.76±1.25) mg/L和(10.97±1.01) mg/g葡萄糖，較出發(fā)菌株BS120提升分別為92.73%和133.26%，優(yōu)于BS120((134.26±2.69) mg/L和(4.69±0.19) mg/g葡萄糖)、BSG1((178.91±1.25) mg/L和(6.68±0.83) mg/g葡萄糖)及BSG3((194. 07±1.86) mg/L和(7.60±0.59) mg/g葡萄糖)。

2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

誘變菌株在不斷傳代的過程中可能出現(xiàn)退化現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵性能下降，因此需要測試誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。由圖7中知，BSG1、BSG3和BSG5產(chǎn)量基本穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 BS120，BSG1，BSG3和BSG5遺傳穩(wěn)定性測試Fig.7 Genetic stability of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5

3 結(jié)論與展望

本研究以BS120為出發(fā)菌株，依次使用8-氮鳥嘌呤和寡霉素作為篩選拮抗物，篩選到了核黃素產(chǎn)量顯著提高的突變株，說明ARTP誘變與合適的拮抗物篩選技術(shù)，是人工合成誘變獲得枯草芽孢桿菌高產(chǎn)突變株的有效手段。將來的工作可以圍繞兩方面進(jìn)行展開：一方面，可以考慮選用其他與核黃素生產(chǎn)相關(guān)的結(jié)構(gòu)類似物如玫瑰黃素、6-氯鳥嘌呤、別嘌呤[19]等作為篩選拮抗物進(jìn)行誘變篩選，并結(jié)合具有更高篩選通量的的篩選技術(shù)，如流式細(xì)胞分選儀或者微流滴細(xì)胞分選儀[26]，以胞內(nèi)核黃素?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度為分選標(biāo)記，通過迭代誘變篩選，獲得生產(chǎn)性狀更加優(yōu)越的誘變菌種；另一方面，可以通過對(duì)誘變菌株的基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組的分析，深入理解突變菌株高產(chǎn)核黃素的遺傳調(diào)控機(jī)理，通過逆向代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)核黃素菌株，獲得到產(chǎn)量較高且遺傳背景清晰的核黃素高產(chǎn)菌，為進(jìn)一步闡釋枯草芽孢桿菌產(chǎn)核黃素遺傳基礎(chǔ)，探討核黃素高產(chǎn)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。