龐佳坤，鄭遠(yuǎn)榮，劉振民*，包怡,3，陳森怡，黨慧杰

1(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)3(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海，200444)

乳清是以牛乳為原料生產(chǎn)干酪過(guò)程中的主要副產(chǎn)品之一。而乳清蛋白是乳清的主要固形物之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物利用效率，被廣泛的應(yīng)用于各種食品中。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白及其他多種活性成分組成。其中，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白分別約占乳清蛋白的50%和19%，均為球狀蛋白質(zhì)。乳清蛋白產(chǎn)品可以分為蛋白質(zhì)含量在35%～85%的乳清濃縮蛋白(whey protein concentration，WPC)和蛋白質(zhì)含量在90%以上的乳清分離蛋白(whey protein isolates，WPI)等。

超高壓(ultra-high pressure, UHP)是一種非熱處理技術(shù)。通過(guò)將樣品密封于腔體中，以水或其他流體作為傳壓介質(zhì)，在儀器內(nèi)部瞬時(shí)且均勻的將壓力傳送至樣品。超高壓技術(shù)能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而改變蛋白質(zhì)的功能特性。超高壓一般不會(huì)改變蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵及氫鍵，對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)基本無(wú)影響，但會(huì)明顯改變蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵，從而影響其高級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。超高壓技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，與蛋白質(zhì)的種類(lèi)、濃度、壓力大小、施壓時(shí)間、溫度和pH有關(guān)[2]。

近年來(lái)，超高壓技術(shù)在食品中有著廣泛的應(yīng)用，研究表明經(jīng)過(guò)20 min和 400 MPa處理的干酪抗氧化性能顯著提高[3]。將超高壓技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量更高的WPI時(shí)，發(fā)現(xiàn)超高壓處理可以增強(qiáng)其抗氧化活性，這可能與蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的部分瓦解及埋藏于乳清蛋白內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露有關(guān)。WPI中3種主要蛋白對(duì)超高壓的抵抗能力的大小為β-乳球蛋白>免疫球蛋白>α-乳白蛋白[4]。并且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)導(dǎo)致暴露出更多的酶切位點(diǎn)，從而提高后續(xù)蛋白酶水解的效率，因此超高壓也是一種有效的預(yù)處理方式[5]。但由于WPI包含了種類(lèi)繁多的蛋白，因此各種蛋白之間的存在使得超高壓誘導(dǎo)的變性機(jī)制變得十分復(fù)雜。例如，超高壓處理容易使得免疫球蛋白的球狀結(jié)構(gòu)展開(kāi)，從而有利于免疫球蛋白通過(guò)二硫鍵與其他的蛋白結(jié)合而形成聚集體[6]。本研究的目的是對(duì)WPI進(jìn)行不同壓力和時(shí)間條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理?xiàng)l件對(duì)WPI結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響，為超高壓技術(shù)在乳清蛋白產(chǎn)品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%)，購(gòu)于馬可瑞斯商貿(mào)(上海)有限公司；其他所有試劑均為分析純。FPG7100型超高壓，德國(guó)IKA公司；SepectraMax M5酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Nicolet6 700傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Waltham公司；SPECORD-205紫外分光光度計(jì)，德國(guó)analytikjena公司； PROTEAN3電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Geldoc-XR+凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓處理

配制WPI溶液(10 g/L)，將100 mL的WPI溶液分裝于聚乙烯袋中并真空包裝，置于超高壓容器中?？疾斐邏簤毫?100、200、300、400、500、600 MPa)、時(shí)間(5、15、30 min)等因素對(duì)WPI的影響。

1.2.2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

將不同處理前后的WPI(1 mg/mL)分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用15%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳初始電壓為100 V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)電壓調(diào)至200 V，待樣品泳動(dòng)至距凝膠底部0.5 cm處停止電泳。

1.2.3 表面疏水性的測(cè)定

參考KATO等[7]的方法，進(jìn)行表面疏水性(surface hydrophobicity, Ho)的測(cè)定。采用1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalisene sulfonate, ANS)作為熒光探針。用pH 7.0的PBS(10 mmol/L)連續(xù)稀釋經(jīng)超高壓處理后的WPI樣品，使其最終濃度為0.062 5～1 mg/mL。在稀釋過(guò)后的2 mL WPI樣品溶液中，加入10 μL的ANS(8.0 mmol/L)，振蕩后靜置3 min。利用SepectraMax M5酶標(biāo)儀，在390 nm(激發(fā)波長(zhǎng))與470 nm(發(fā)射波長(zhǎng))的條件下，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。表面疏水性Ho值用熒光強(qiáng)度與WPI濃度比值的斜率表示。

1.2.4 乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum, FTIR)被用來(lái)分析不同超高壓處理前后WPI的構(gòu)象變化。稱取WPI樣品的凍干粉與干KBr混合，壓片后，利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描(4 000～400 cm-1)。

1.2.4.2 自由巰基含量測(cè)定

參考AMBROSI等[2]的方法，進(jìn)行自由巰基含量的測(cè)定。250 μL的WPI樣品和1 mL 的Tris-甘氨酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含有0.1 mol/L甘氨酸，8 mol/L尿素)進(jìn)行混合，隨后加入10 μL的Ellman’s 試劑(4 mg/mL)。室溫(25 ℃)孵育30 min后，測(cè)量412 nm處的吸光度(A412)。自由巰基的含量通過(guò)公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式中：A412，412nm處吸光度；D，稀釋度；C，WPI中的蛋白濃度，mg/mL；自由基含量巰，μmol/g蛋白。

1.2.4.3 內(nèi)源熒光光譜分析

參考GINA等[8]的方法，將不同超高壓處理前后WPI樣品利用酶標(biāo)儀進(jìn)行色氨酸內(nèi)源性熒光測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，掃描300～400 nm的發(fā)射光譜。

1.2.5 乳清分離蛋白抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考ATHIRA等的方法[9]，測(cè)定ABTS自由基清除活性。在20 mL 7 mmol/L ABTS溶液中加入2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀，制成40 mL ABTS+·工作液，使用前室溫避光靜置12～16 h。之后將ABTS+·工作液用PBS稀釋至合適的倍數(shù)(20～50倍)，使734 nm下的吸光度為(0.70±0.02)。取5 μL的WPI樣品加入到500 μL稀釋后的ABTS+·工作液中。室溫反應(yīng)6 min后，測(cè)定734 nm處的吸光度。清除率通過(guò)公式(2)計(jì)算，結(jié)果用1g WPI中Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g 蛋白)。

(2)

式中：As，加入樣品后ABTS+·工作液吸光度；Ab，空白對(duì)照組吸光度；Ad，未加樣品時(shí)ABTS+·工作液的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考BRAND-WILLIAMS等[10]的方法，測(cè)定DPPH自由基清除活性。將1 mL WPI樣品加入到4 mL的DPPH溶液(60 mmol/L)中。室溫避光反應(yīng)30 min后，測(cè)定517 nm處的吸光度。清除率通過(guò)公式(3)計(jì)算，結(jié)果用1g WPI中Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g 蛋白)。

(3)

式中：A0，DPPH溶液吸光度；A1，樣品+DPPH溶液吸光度；A2，樣品溶液吸光度。

1.2.5.3 總還原力的測(cè)定

參考YEN等[11]的方法測(cè)量WPI的總還原力。將200 μL的WPI樣品加入到0.5 mL PBS(0.2 mol/L，pH 6.6)和0.5 mL鐵氰化鉀(10 g/L)中。50 ℃反應(yīng)20 min后加入0.5 mL三氯乙酸(100 g/L)。3 000 r min條件下離心10 min，取0.5 mL上清液與0.5 mL去離子水、0.1 mL三氯化鐵 FeCl3(1 g/L)混合，反應(yīng)10 min后，測(cè)定700 nm處的吸光度。吸光度越高，說(shuō)明樣品還原能力越強(qiáng)。結(jié)果用1g WPI中Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g 蛋白)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel及GraphPad prism 7.04軟件對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓對(duì)乳清分離蛋白電泳特性的影響

超高壓處理后WPI的電泳特性如圖1所示，超高壓處理前后的WPI電泳條帶均位于14.4、18.4 kDa附近，這與WPI的蛋白成分保持一致，WPI的主要成分β-乳球蛋白的分子質(zhì)量為18 kDa左右、α-乳白蛋白的分子質(zhì)量為14.4 kDa左右。不同超高壓處理后的WPI的電泳特性并沒(méi)有發(fā)生顯著改變，各條帶之間差異不明顯。這表明超高壓處理并未引起WPI分子質(zhì)量的改變，且WPI未降解。

圖1 WPI 的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of WPI注：M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，WPI-未處理樣品，A1-100 MPa，5 min，A2-100 MPa，15 min，A3-100 MPa，30 min，B1-200 MPa，5 min，B2-200 MPa，15 min，B3-200 MPa，30 min，C1-300 MPa，5 min，C2-300 MPa，15 min，C3-300 MPa，30 min，D1-400 MPa，5 min，D2-400 MPa，15 min，D3-400 MPa，30 min，E1-500 MPa，5 min，E2-500 MPa，15 min，E3-500 MPa，30 min，F(xiàn)1-600 MPa，5 min，F(xiàn)2-600 MPa，15 min，F(xiàn)3-600 MPa，30 min

2.2 超高壓對(duì)乳清分離蛋白表面疏水性的影響

氨基酸殘基的非極性側(cè)鏈基團(tuán)之間的疏水相互作用對(duì)維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用，因此表面疏水性常被用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]，并且疏水基團(tuán)能夠加強(qiáng)蛋白質(zhì)與疏水性多不飽和脂肪酸互作，使蛋白質(zhì)與氧結(jié)合或抑制脂質(zhì)中氫的釋放，從而保護(hù)脂質(zhì)體系、膜質(zhì)的完整性，起到抗氧化作用[13]。超高壓對(duì)WPI表面疏水性的影響如圖2所示，與對(duì)照組即未處理的WPI相比，100 MPa處理后的WPI表面疏水性無(wú)顯著變化，超高壓200 MPa及以上壓力處理后WPI表面疏水性則顯著上升。這可能是由于蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，使原先包埋在球狀蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在表面，導(dǎo)致了表面疏水性增加。當(dāng)壓力一定時(shí)，WPI的Ho值隨著時(shí)間的增加而增加。當(dāng)保壓時(shí)間分別為5 min和15 min時(shí)，WPI的Ho值隨著壓力的增加而增加，這表明蛋白質(zhì)疏水區(qū)的暴露程度隨著壓力的增大而增加。當(dāng)保壓時(shí)間為30 min時(shí)，WPI的Ho值在400 MPa達(dá)到最大值(2 121.4)，之后隨著壓力的增加Ho值略有下降。這可能是由于當(dāng)保壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，較高的壓力使蛋白質(zhì)疏水氨基酸暴露過(guò)多導(dǎo)致更易發(fā)生疏水反應(yīng)，使得展開(kāi)的蛋白質(zhì)分子重新聚集形成新的聚合體而導(dǎo)致檢測(cè)到的疏水性氨基酸殘基減少[14]。而有研究表明[14-16]，超高壓處理后，大豆蛋白分離物的Ho值隨壓力的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，花生分離蛋白則隨壓力增加呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，這說(shuō)明不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)所受壓力的影響存在差異。

圖2 不同超高壓處理對(duì)WPI表面疏水性的影響Fig.2 Effects of different UHP treatments on surface hydrophobicity of WPI注：小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.3 超高壓對(duì)乳清分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 超高壓對(duì)乳清分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

酰胺I帶通常用于分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)適當(dāng)?shù)臄M合、分峰和峰面積計(jì)算，可以比較WPI中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化[17]。從上述實(shí)驗(yàn)中選取具有顯著性差異，壓力分別為200、400、600 MPa，時(shí)間為5 min、30 min的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，考察超高壓對(duì)WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。由表1可以看出，超高壓處理過(guò)后WPI的α-螺旋含量顯著升高，其中400 MPa-30 min的α-螺旋含量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時(shí)，WPI的α-螺旋含量反而降低，這可能是發(fā)生了解螺旋現(xiàn)象。超高壓處理后WPI的β-折疊的含量顯著降低，在400 MPa-30 min時(shí)降至最低，這可能與蛋白質(zhì)的部分展開(kāi)有關(guān)。當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時(shí)，WPI的β-折疊含量反而升高，這可能是發(fā)生了一定程度的重新折疊。β-轉(zhuǎn)角的含量在400MPa-5 min 和400 MPa-30 min時(shí)達(dá)到最高。無(wú)規(guī)則卷曲的含量與對(duì)照組相比顯著降低。這些結(jié)果表明，超高壓處理可以使WPI的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，使β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和β-轉(zhuǎn)角，降低β-折疊的含量，對(duì)WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。

表1 超高壓處理前后WPI二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 1 Secondary structure analysis of WPI before and after UHP treatments

2.3.2 超高壓對(duì)乳清分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

自由巰基(—SH)及二硫鍵(—S—S—)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起著重要的作用，并且有研究表明含巰基的半胱氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的抗氧化活性具有影響[18]。超高壓處理對(duì)WPI巰基的影響如圖3所示。超高壓處理后，WPI的自由巰基含量發(fā)生明顯變化，這是由于超高壓使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生—SH/—S—S—互換反應(yīng)，使得自由巰基和二硫鍵相互轉(zhuǎn)化。對(duì)照組即未處理的WPI自由巰基含量為12.46 μmol/g蛋白，超高壓處理后的WPI自由巰基含量明顯增加，在400 MPa-30 min時(shí)提高了49%，達(dá)到最大值(16.63 μmol/g蛋白)。由圖3可以看出，當(dāng)壓力一定時(shí)，保壓時(shí)間越長(zhǎng)，WPI的自由巰基含量越高，表明超高壓對(duì)WPI 的影響與保壓時(shí)間相關(guān)，這與HINRICHS等[19]的研究一致。而在相同的保壓時(shí)間下，隨著壓力的增加，WPI自由巰基含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。KLEBER等[5]認(rèn)為蛋白質(zhì)在受壓變性的過(guò)程中存在一個(gè)壓力閾值，低于壓力閾值時(shí)蛋白質(zhì)的展開(kāi)是可逆的。因此當(dāng)壓力為200 MPa時(shí)，WPI受壓后發(fā)生可逆展開(kāi)，壓力釋放后蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的重新折疊。當(dāng)壓力為600 MPa時(shí)，WPI發(fā)生不可逆的變性聚集。當(dāng)壓力為400 MPa時(shí)，WPI變性伸展，暴露出最多的巰基基團(tuán)，這與JOSEFINA等[20]的結(jié)果類(lèi)似。

圖3 超高壓處理對(duì)WPI自由巰基含量的影響Fig.3 Effects of different UHP treatments on free sulfhydryl contents of WPI

WPI中的色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸能夠發(fā)射熒光，因此常常被用作內(nèi)源性探針檢測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化[21]。因此WPI的色氨酸熒光光譜可以反應(yīng)出WPI的結(jié)構(gòu)變化。熒光強(qiáng)度的變化以及圖譜的藍(lán)移和紅移反應(yīng)了氨基酸側(cè)鏈發(fā)生改變[22]。由圖4可知，與對(duì)照組即未處理的WPI相比，200 MPa-5 min、200 MPa-30 min、400 MPa-5 min組的WPI熒光強(qiáng)度略有下降，而400 MPa-30 min、600 MPa-5 min、600 MPa-30 min組的WPI的熒光強(qiáng)度則顯著增強(qiáng)。所有實(shí)驗(yàn)組的圖譜發(fā)生均發(fā)生明顯紅移。在相同壓力下，隨著保壓時(shí)間的增加，WPI的熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在相同保壓時(shí)間下，隨著壓力的增加，WPI內(nèi)源熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。并且400 MPa條件下的WPI熒光強(qiáng)度不僅高于200 MPa，400 MPa-30 min組的熒光強(qiáng)度還略高于600 MPa-5 min組，600 MPa-30 min組的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，熒光強(qiáng)度的變化表明超高壓處理后色氨酸殘基在溶劑中的暴露量發(fā)生變化[23]。超高壓處理使得蛋白質(zhì)展開(kāi)導(dǎo)致色氨酸殘基在溶劑中的暴露量改變，這些結(jié)果證實(shí)了超高壓處理對(duì)WPI的變性作用。

圖4 超高壓處理前后WPI內(nèi)源熒光光譜Fig.4 Endogenous fluorescence spectra of WPI before and after UHP treatments

2.4 超高壓對(duì)乳清分離蛋白抗氧化活性的影響

抗氧化劑的抗氧化活性是由不同的機(jī)制所引起的，包括DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、總還原力，或是這些因素的組合[24]，較高的ABTS值、DPPH值和還原力值代表著較高的抗氧化活性。有研究表明[25]，超高壓處理會(huì)導(dǎo)致冰沙的抗氧化活性增加。超高壓處理WPI對(duì)抗氧化活性的影響如表2所示，與對(duì)照組即未處理的WPI相比，經(jīng)過(guò)超高壓處理的WPI明顯具有更高的ABTS自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和總還原力。但與對(duì)照組(0.7±0.07)相比，200 MPa-5 min組的DPPH自由基清除活性略有降低。

由表2可以看出，在保壓時(shí)間為5 min的情況下，壓力越大，WPI的ABTS自由基清除活性越大。在保壓時(shí)間為30 min的情況下，WPI的ABTS自由基清除活性隨壓力的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在400 MPa-30 min組時(shí)達(dá)到最大值，且差異顯著，DPPH自由基清除活性也顯示出了相同的趨勢(shì)。在壓力為200 MPa和400 MPa時(shí)，WPI的ABTS自由基清除活性和DPPH自由基清除活性均隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而當(dāng)壓力為600 MPa時(shí)，ABTS自由基清除活性和DPPH自由基清除活性反而隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。WPI的還原力則是在200 MPa時(shí)，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而略有降低，在400 MPa和600 MPa時(shí)，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在保壓時(shí)間一定時(shí)，壓力越大，WPI的還原力也越大。

超高壓處理對(duì)WPI抗氧化活性的影響，可能與蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化有關(guān)。超高壓處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的展開(kāi)，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使原本埋藏在天然蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的活性基團(tuán)如疏水基團(tuán)等暴露于溶劑中，因此增強(qiáng)了自由基清除能力導(dǎo)致抗氧化活性的提高。

表2 超高壓處理對(duì)WPI抗氧化活性的影響Table 2 Effects of different UHP treatments on antioxidant activity of WPI

注：TE=Trolox 當(dāng)量

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)WPI進(jìn)行不同壓力和時(shí)間條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理?xiàng)l件對(duì)WPI結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響。相對(duì)于未經(jīng)處理的WPI，200 MPa及以上壓力處理后WPI的表面疏水性顯著上升(P<0.05)，在400 MPa-30 min時(shí)達(dá)到最大值(2 121.4)，而100 MPa的超高壓處理則對(duì)WPI的表面疏水性無(wú)顯著影響(P>0.05)。這可能是由于一定的壓力使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，原先位于WPI內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露在表面，導(dǎo)致表面疏水性增加。對(duì)于WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)，超高壓處理后使WPI 的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和β-轉(zhuǎn)角，降低β-折疊的含量，對(duì)WPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。對(duì)于WPI三級(jí)結(jié)構(gòu)，自由巰基含量在400 MPa-30 min時(shí)提高了49%，達(dá)到最大值，這表明壓力使WPI變性伸展，暴露出最多的巰基基團(tuán)。并且400 MPa-30 min的WPI內(nèi)源熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比也表現(xiàn)出了顯著變化，證明了超高壓處理引起色氨酸殘基的變化，導(dǎo)致WPI三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)。在所有的超高壓處理?xiàng)l件中，400 MPa-30 min對(duì)WPI結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，并顯示出了最高的抗氧化活性。

綜上所述，超高壓處理能顯著改變WPI的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而對(duì)抗氧化活性產(chǎn)生影響。本研究為超高壓技術(shù)在乳清蛋白產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，有利于促進(jìn)超高壓技術(shù)在乳制品加工領(lǐng)域的應(yīng)用。