劉孝平，劉路，魯炫池，段昕梅，張玲，陳安均

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安，625014)

羅望子(TamarindusindicaL.)屬于蘇木科(Caesalpiniaceae)酸角屬(Tamarindus)，又稱酸角、酸豆、羅晃子等。羅望子果肉含有豐富的糖類、有機(jī)酸、氨基酸和礦物質(zhì)元素。除此之外，羅望子果肉中還含有較多的多糖類、酚類和黃酮類化合物[1-2]及豐富的生物活性物質(zhì)[3]，可以被加工為糕點(diǎn)、蜜餞、果脯、果肉粉、濃縮汁和咖喱粉等產(chǎn)品[4]。

如今，隨著生活水平的提高，人們的消費(fèi)觀念發(fā)生變化，人們開始熱衷選擇營(yíng)養(yǎng)豐富的渾濁型果汁飲料。渾濁型羅望子飲料最主要的問題是在貯藏和運(yùn)輸過程中會(huì)出現(xiàn)固體顆粒的沉淀，這會(huì)對(duì)消費(fèi)者的感官造成負(fù)面影響[5]。而非熱加工是目前果汁加工的趨勢(shì)，例如通過高壓均質(zhì)、超高壓[6]、超聲[7]和高壓脈沖電場(chǎng)[8]等處理來保護(hù)果汁的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)或延長(zhǎng)貨架期，其中高壓均質(zhì)是應(yīng)用最廣泛的加工方式之一。

根據(jù)Stokes公式，顆粒沉降速度與顆粒粒徑成正比，顆粒尺寸越小，沉降速度越慢，因而在果汁加工中常用均質(zhì)處理降低果汁顆粒的粒徑，以提高產(chǎn)品的物理穩(wěn)定性。高壓均質(zhì)能夠破壞食品基質(zhì)，破壞果肉細(xì)胞的完整性，將細(xì)胞破碎成碎片，從而導(dǎo)致果汁的平均粒徑降低，顆粒分布變窄，果汁穩(wěn)定性增強(qiáng)。但是高壓均質(zhì)處理時(shí)，樣品經(jīng)過高壓均質(zhì)閥時(shí)受壓力、剪切力、高速碰撞、空穴效應(yīng)等作用可能會(huì)對(duì)果汁中生物活性物質(zhì)產(chǎn)生一些難以控制的影響。

高壓均質(zhì)技術(shù)可以用于改善各種果汁的物理穩(wěn)定性，但是目前沒有關(guān)于利用高壓均質(zhì)處理羅望子濁汁的相關(guān)研究。本研究的目的是：(1)研究高壓均質(zhì)處理?xiàng)l件對(duì)羅望子濁汁物理穩(wěn)定性的影響(離心沉淀率、清液濁度、粒徑分布)；(2)盡量減小高壓均質(zhì)處理對(duì)羅望子濁汁生物活性的影響(總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化能力)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟的甜型羅望子果實(shí)產(chǎn)自云南省西雙版納，購于昆明市建航商貿(mào)有限公司。運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后立即剔除受到蟲害和霉變的果實(shí)，剝?nèi)」饷芊夂笤?20 ℃冰箱存放。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、水楊酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、氯化鐵、碳酸鈉、福林酚試劑均為分析純，購于成都科隆化學(xué)品有限公司。纖維素酶(酶活：10萬U/g，最適溫度50 ℃，最適pH 4.8)為食品級(jí)，購于和氏璧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Rise-2006型激光粒度儀，濟(jì)南潤(rùn)之科技有限公司；ZDG型濁度儀，無錫市優(yōu)量智能流量?jī)x表有限公司；Varioskan Flash型熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；GJJ型高壓均質(zhì)機(jī)，上海諾尼輕工機(jī)械有限公司；JYL-C012型打漿機(jī)，九陽股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法和均質(zhì)條件

將羅望子果肉以固液比1∶11混合浸泡30 min，使羅望子果肉質(zhì)地變軟利于打漿。然后將果肉和水的混合物一起倒入打漿機(jī)中進(jìn)行打漿，大約1 min后觀察到果漿中沒有果肉顆粒判斷為制漿完成。向制備好的羅望子果漿中加入底物濃度1.5‰的纖維素酶，混合均勻后于50 ℃水解50 min。酶解好的羅望子果漿經(jīng)過300目濾袋粗濾后分裝到飲料瓶中。制備好的羅望子濁汁經(jīng)過水浴平衡20 min后轉(zhuǎn)移至均質(zhì)機(jī)進(jìn)料口中，調(diào)節(jié)壓力閥，按照條件對(duì)羅望子濁汁進(jìn)行均質(zhì)。均質(zhì)完成的樣品立即水浴冷卻后裝入無菌玻璃瓶中在4 ℃儲(chǔ)存直至分析。在控制進(jìn)料溫度為50 ℃、均質(zhì)壓力20 MPa、均質(zhì)次數(shù)為2次的基礎(chǔ)條件下，改變其中一項(xiàng)均質(zhì)條件對(duì)羅望子濁汁進(jìn)行處理。選取均質(zhì)壓力0～30 MPa，進(jìn)料溫度20～70 ℃，均質(zhì)次數(shù)0～5次。

1.3.2 濁汁離心沉淀率和上清液濁度的測(cè)定

稱量5 mL離心管的質(zhì)量m1，加入3.5 mL均質(zhì)后的樣品溶液，稱量離心管和飲料的質(zhì)量m2，以250 g的離心力離心20 min，取上層清液用蒸餾水稀釋20倍后放入玻璃樣杯中用濁度儀測(cè)定濁汁上清液濁度。拭去蓋子、管口及內(nèi)壁上的殘余液體后精確稱量離心管和沉淀的質(zhì)量m3，按照公式(1)計(jì)算離心沉淀率SR，離心沉淀率SR越大，說明飲料的穩(wěn)定性越差。

(1)

1.3.3 激光粒度儀分析

用激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定，在室溫下吸取一定量的羅望子濁汁加入到以蒸餾水為分散介質(zhì)中，調(diào)節(jié)遮光比大于0.6，測(cè)定羅望子濁汁粒度分布曲線。

1.3.4 總酚的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteus法[9]，取樣品0.4 mL，加入2 mL稀釋10倍的Folin酚試劑，反應(yīng)5min后加入10% Na2CO3溶液3 mL，混合均勻后常溫放置1 h，于765 nm處測(cè)定OD值，對(duì)比相應(yīng)的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.3.5 總黃酮的測(cè)定

采用分光光度法，吸取稀釋了2倍的樣品溶液0.3 mL，加入30%的乙醇溶液3.4 mL和0.5 mol/L的NaNO2溶液0.5 mL，6 min后加入0.3 mol/L的AlCl3·6H2O溶液0.15 mL，6 min后在410 nm處測(cè)定波長(zhǎng)，并對(duì)比相應(yīng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量[9]。

1.3.6 抗氧化能力的測(cè)定

利用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力[10-11]評(píng)價(jià)羅望子濁汁的體外抗氧化能力。

對(duì)于DPPH自由基的清除能力，將1 mL混勻后的羅望子濁汁與0.5 mL 0.35 mg/mL DPPH乙醇溶液振動(dòng)均勻后在暗處反應(yīng)20 min后在517 nm測(cè)量溶液的OD值。

對(duì)于ABTS自由基的清除能力，首先將ABTS粉末用蒸餾水溶解為濃度為7 mmol/L的ABTS溶液，再與濃度為140 mmol/L的K2S2O8溶液混合，室溫避光靜置過夜。使用時(shí)用0.1 mol/L PBS緩沖液稀釋，要求其在734 nm波長(zhǎng)下的OD值為0.70±0.02。取稀釋后的ABTS自由基溶液3.9 mL加入0.1 mL樣品振蕩后在黑暗處靜置10 min后在734 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)于羥自由基清除能力，向試管中依次加入1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液和稀釋10倍的羅望子濁汁樣品，充分混合后迅速轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)30 min后在510 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)于不同自由基清除能力的測(cè)定，均用蒸餾水替代樣品溶液作為陰性對(duì)照，結(jié)果表示為羅望子濁汁中抗壞血酸當(dāng)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組測(cè)量實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)為平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Microsoft Excel 2013進(jìn)行基本數(shù)據(jù)處理，用軟件SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)對(duì)羅望子濁汁粒度分布的影響

不同高壓均質(zhì)壓力、進(jìn)料溫度和均質(zhì)次數(shù)對(duì)羅望子濁汁粒度的影響如圖1所示。所有的樣品均呈現(xiàn)單峰分布。由圖1-A可以看出，未進(jìn)行均質(zhì)處理的樣品粒度分布范圍最大。其中，從1～7 μm的顆粒占顆粒總體積的90%以上。隨著均質(zhì)壓力的提升，羅望子濁汁的粒度分布迅速向低粒度區(qū)域移動(dòng)。同時(shí)還觀察到隨均質(zhì)壓力的升高，濁汁粒度分布范圍明顯變得集中，當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到15 MPa以上時(shí)，繼續(xù)提升壓力羅望子濁汁的粒度分布幾乎沒有變化。這表明較大的果肉顆粒經(jīng)過壓力閥時(shí)被破碎成較小的顆粒，這種變化規(guī)律與橙汁、番茄汁和菠蘿汁相同[12-14]。當(dāng)均質(zhì)壓力到達(dá)15 MPa以上時(shí)，2 μm以下的顆粒占顆粒總體積90%以上。由圖1-B可以看出，在壓力為20 MPa、均質(zhì)次數(shù)2次的條件下，溫度的變化對(duì)羅望子濁汁的粒度影響不顯著，但是由圖1可以看出40～60 ℃條件下，羅望子濁汁中顆粒的平均粒徑較低，較高的溫度使得濁汁粒度部分增加可能是較高的入口溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凝固[15]。由圖1-C可以看出均質(zhì)次數(shù)對(duì)羅望子濁汁粒度影響顯著，均質(zhì)1次后，濁汁的粒徑迅速減小，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)達(dá)到2次后，繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)無法明顯的減小濁汁的粒度。

A-50℃/0～30 MPa/2次；B-30～70℃/20 MPa/2次；C-50℃/20 MPa/0～5次圖1 不同均質(zhì)壓力、進(jìn)料溫度和均質(zhì)次數(shù)的粒度分布曲線Fig.1 Particle size distribution curves of different homogenizing pressures, feeding temperature and passes number

2.2 高壓均質(zhì)對(duì)羅望子濁汁離心沉淀率與清液濁度的影響

不同條件高壓均質(zhì)處理對(duì)羅望子濁汁離心沉淀率和清液濁度的影響如圖2所示。渾濁型果汁中含有較多的懸浮顆粒，這些懸浮顆粒常常是不溶性的果膠、蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素，它們通過吸收光線造成了果汁的渾濁。由圖1-A得知，隨著均質(zhì)壓力的增加濁汁離心沉淀率顯著下降，清液濁度顯著上升。由斯托克斯定律，顆粒的沉降速度與顆粒粒徑成正比，顆粒尺寸越小沉降速度越慢。未均質(zhì)的樣品顆粒尺寸大，容易在離心過程中沉降下來，因此離心后清液的濁度也較低[16]。隨著均質(zhì)壓力的增加，果肉中顆粒逐漸降低，所以濁汁的穩(wěn)定性也提高了。但是當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到20 MPa后，濁汁離心沉淀率和清液濁度均變得穩(wěn)定，這與濁汁的粒度分布結(jié)果相似。由圖1-B可知，適當(dāng)進(jìn)料溫度有利于濁汁離心沉淀率的下降和清液濁度的提高，但當(dāng)進(jìn)料溫度提高至50 ℃以上時(shí)，濁汁離心沉淀率升高且清液濁度下降，這可能是因?yàn)?0 ℃條件下蛋白質(zhì)等變性造成顆粒聚集，從而導(dǎo)致濁汁穩(wěn)定性降低。由圖1-C可以看出，2次均質(zhì)對(duì)濁汁的離心沉淀率和清液濁度有顯著的影響，能顯著提高濁汁的穩(wěn)定性。但是當(dāng)均質(zhì)次數(shù)超過3次后，濁汁的離心沉淀率上升且清液濁度下降。這可能是因?yàn)檫^多的均質(zhì)次數(shù)使果汁中顆粒粒徑變小、表面積增大、顆粒之間的相互作用增強(qiáng)，且均質(zhì)過程中提供大量能量導(dǎo)致了小顆粒快速重新聚集[17-18]。

A-50 ℃/0～30 MPa/2次；B-30～70 ℃/20 MPa/2次；C-50 ℃/20 MPa/0～5次圖2 不同均質(zhì)壓力、進(jìn)料溫度和均質(zhì)次數(shù)條件下離心沉淀率和上清液濁度的變化Fig.2 Changes of centrifugal precipitation rate and turbidity of supernatant at different homogenizing pressure,feeding temperatureand passes number注：不同字母表示不同提取條件間差異顯著(P<0.05),下同

2.3 均質(zhì)條件對(duì)濁汁活性物質(zhì)及抗氧化活性的影響

均質(zhì)壓力、進(jìn)料溫度和均質(zhì)次數(shù)變化對(duì)羅望子濁汁活性物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響如表1所示。對(duì)于所有的處理，濁汁中多糖含量與對(duì)照組相比均沒有顯著差異，這與BENGTSSON等的研究結(jié)果相似[19]。對(duì)于均質(zhì)壓力，較低的均質(zhì)壓力能顯著提高濁汁總酚含量、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力。15 MPa的均質(zhì)壓力處理與對(duì)照組相比，濁汁總酚含量、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力分別提高了13.45%、10.06%和7.77%。但是對(duì)于過高的均質(zhì)壓力，濁汁黃酮含量、ABTS自由基清除能力和清自由基清除能力與對(duì)照組相比均發(fā)生顯著下降。對(duì)于進(jìn)料溫度溫度，隨進(jìn)料溫度的上升，除多糖含量外所有指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)進(jìn)料溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，總酚含量、黃酮含量、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力與室溫進(jìn)料相比均下降顯著。對(duì)于均質(zhì)次數(shù)，2次均質(zhì)有利于濁汁活性物質(zhì)的溶出，但當(dāng)均質(zhì)次數(shù)達(dá)到4次，濁汁中總酚含量和黃酮含量顯著降低。

這種現(xiàn)象可能由多種因素決定，一方面，高壓均質(zhì)減小果汁中懸浮物的粒度，可能使結(jié)合狀態(tài)的酚類物質(zhì)釋放出來，成為游離態(tài)的酚類而被檢測(cè)到[20]。但另一方面，由于高壓均質(zhì)處理激活了濁汁中多酚氧化酶和糖苷酶的活性，使?jié)嶂械牟糠侄喾宇愇镔|(zhì)降解[21]。且高壓均質(zhì)過程中的空穴效應(yīng)可能使得濁汁溶解氧濃度升高，導(dǎo)致了多酚類物質(zhì)的氧化分解[22]。另外，均質(zhì)過程中使?jié)嶂瓬囟壬?，可能?dǎo)致體系內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)速率加快。

2.4 相關(guān)性分析

濁汁活性物質(zhì)含量與濁汁體外抗氧化活性指標(biāo)間相關(guān)性分析結(jié)果如圖3，濁汁多糖含量與3種自由基清除能力間沒有顯著相關(guān)性，濁汁總酚含量與DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.808和0.679。濁汁黃酮含量與羥自由基清除能力呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.543；濁汁黃酮含量與ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.934和0.581。酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)被認(rèn)為具有良好的抗氧化活性，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)與3種自由基清除能力的正相關(guān)關(guān)系說明了它們是影響羅望子濁汁抗氧化能力的重要因素。3種自由基清除能力之間也呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，說明這3種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法能有效地反映濁汁的抗氧化活性。

表1 均質(zhì)條件變化對(duì)羅望子濁汁活性物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響Table 1 Effect of homogenization conditions on the content of active substances and antioxidant activity in turbid juice of tamarind

注：同一列不同小寫字母表示具有顯著性(P<0.05)

圖3 濁汁活性物質(zhì)含量與濁汁體外抗氧化活性指標(biāo)間相關(guān)性分析結(jié)果Fig.3 Results of correlation analysis between the content of active substances in turbid juice and the antioxidant activity indexes in vitro注：*表示在P<0.05水平條件下的相關(guān)顯著性；**表示P<0.01水平條件下的相關(guān)顯著性

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)木|(zhì)條件可以提高濁汁穩(wěn)定性且較大程度保留濁汁的活性物質(zhì)含量，但是過于強(qiáng)烈的均質(zhì)條件會(huì)導(dǎo)致濁汁穩(wěn)定性和活性物質(zhì)含量下降。為在盡可能提高濁汁穩(wěn)定性的前提條件下保留濁汁較高的抗氧化活性，選擇進(jìn)料溫度水平為40、50和60 ℃，均質(zhì)壓力水平為15、20和25 MPa，均質(zhì)壓力水平為1、2和3次，以濁汁離心沉淀率和上清液濁度為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

由表2可知，離心沉淀率及上清液濁度均呈現(xiàn)相似的結(jié)果，各因素對(duì)濁汁離心沉淀率及上清液濁度影響的主次順序?yàn)榫|(zhì)次數(shù)>均質(zhì)壓力>進(jìn)料溫度，得到最優(yōu)提取工藝為A2B3C2，即：進(jìn)料溫度50 ℃、均質(zhì)壓力25 MPa、均質(zhì)次數(shù)2次。對(duì)最優(yōu)均質(zhì)條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此均質(zhì)條件下，羅望子濁汁離心沉淀率為1.18%、上清液濁度為435.50 NTU。

3 結(jié)論

高壓均質(zhì)處理可以顯著減小羅望子濁汁中顆粒的粒度，隨著均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的增加，濁汁粒度分布向低粒徑區(qū)域移動(dòng)。適當(dāng)?shù)木|(zhì)條件可以提高羅望子濁汁的穩(wěn)定性和抗氧化能力，過多的均質(zhì)次數(shù)或進(jìn)料溫度不利于羅望子濁汁的穩(wěn)定性，過高的進(jìn)料溫度和均質(zhì)次數(shù)甚至?xí)?dǎo)致羅望子濁汁總酚和黃酮含量低于對(duì)照組(P<0.05)，但是濁汁多糖含量對(duì)均質(zhì)條件的變化不敏感。相關(guān)性分析表明，濁汁中總酚含量和黃酮含量與濁汁DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)均質(zhì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)工藝條件為進(jìn)料溫度50 ℃、均質(zhì)壓力25 MPa、均質(zhì)次數(shù)2次，在此均質(zhì)條件下，羅望子濁汁離心沉淀率為1.18%、上清液濁度為435.50NTU。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experimental design and range analysis