吳凡 莊乃保 梁爽 梁延連 蘇宇清

RhD陰性血型作為一種特殊的稀有血型，在我國(guó)所占比例相對(duì)較少。近年來臨床上RhD陰性血需求量呈逐年增加趨勢(shì)，患者也常因術(shù)前無法找到合適匹配的血液而延誤治療。血型改造制備“通用血”是輸血研究的一個(gè)重要課題。多肽藥物的最新研究成果及高效價(jià)抗體可遮蔽Rh抗原的現(xiàn)象提示[1-5]，利用模擬多肽作為遮蔽物，可能會(huì)阻擋抗-D與紅細(xì)胞表面RhD抗原結(jié)合位點(diǎn)，逃避免疫攻擊（immune attack）達(dá)到血液通用的目的。本研究分析噬菌體表面展示技術(shù)篩選得到的RhD陽(yáng)性噬菌體多肽的免疫遮蔽效果[6]，探討利用具有生物活性的多肽遮蔽抗-D與RhD抗原的結(jié)合位點(diǎn)，使用生物信息學(xué)分析有效多肽理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)，以期提高臨床輸血的安全性。現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)試劑 IgG型單克隆抗-D，上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20171023；牛血清白蛋白（BSA），美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：1652C18；熒光抗體FITC-標(biāo)記山羊抗人IgG Fc（ab）2，美國(guó)Bio-rad公司，批號(hào)：STAR97PE；低離子鹽溶液（LISS），美國(guó)Bio-rad公司，批號(hào)：05761.77.30；微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡，美國(guó)Bio-rad公司，批號(hào)：50531.28.17；抗人球蛋白（抗IgG，C3d）檢測(cè)試劑盒，上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20175002；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。多肽，根據(jù)抗-D噬菌體克隆篩選推導(dǎo)出的4條較為有效12肽氨基酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成多肽[6]。多肽純度為95%。

表1 RhD噬菌體多肽合成

2 實(shí)驗(yàn)儀器 SI500搖動(dòng)式培養(yǎng)箱，英國(guó)Stuart Scientific公司； Labofuge 400R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司；Centrifuge 5417R微型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FACSCantoTM流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。ID-Incubator 37 SI保溫箱，瑞士Diamed AG公司；ID-Centrifuge 12 SII臺(tái)式離心機(jī)，瑞士Diamed AG公司；FL Auto顯微鏡細(xì)胞成像儀，美國(guó)Life technologies公司。

3 方法

3.1 多肽理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)分子量、純度和質(zhì)量用生理鹽水溶解多肽，每條多肽分別配制成1 mg/50 μL、0.5 mg/50 μL、0.25 mg/50 μL、0.125 mg/50 μL共4個(gè)濃度。

有效多肽的分子質(zhì)量（mass）、等電點(diǎn)（isoelectric point）、不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）、總平均疏水指數(shù)（grand averge of hydropathicity）使用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protpatam/）進(jìn)行分析。無規(guī)則卷曲（random coil）、抗原性（antigenic）使用在線工具EMBOSS（http：//emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss）進(jìn)行分析。螺旋結(jié)構(gòu)疏水面（hydrophobic face）、疏水力（hydrophobic moment）使用在線工具h(yuǎn)biQuest（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py）進(jìn)行分析。

3.2 多肽驗(yàn)證：20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL/孔加于微孔板中（即每孔1 mg），分別與50 μL 3.1中溶解的不同濃度的多肽混合，37℃輕振孵育30 min。用LISS溶液制備5‰洗滌O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞。加入5‰洗滌O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞25μL/孔，陽(yáng)性對(duì)照孔加入20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL及5‰洗滌O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞25 μL，陰性對(duì)照孔加入20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL及5‰洗滌O型RhD陰性紅細(xì)胞25 μL，37℃輕振孵育30 min。取50 μL反應(yīng)物至微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡中，1 000 g離心10 min。判定結(jié)果。

3.3 多肽遮蔽濃度檢測(cè)：200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50μL，分別與1 mg/50 μL、2 mg/50 μL的Peptide 4 50μL混合于已用0.5% BSA封閉的微孔板中，37℃孵育30 min。陽(yáng)性對(duì)照孔加200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50 μL與生理鹽水50 μL混合，陰性對(duì)照孔加生理鹽水100 μL。加入1%洗滌O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞50μL/孔，37℃孵育1 h。生理鹽水洗滌3次。最后一次洗滌后扣干，加入抗人球蛋白（抗IgG，C3d）100 μL/孔，1 000 g離心15 s，取10 μL/孔涂片，顯微鏡觀察凝集情況。

3.4 多肽遮蔽效果檢測(cè)：200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50 μL，與2.5 mg/50 μL的Peptide 4 50 μL混合于用0.5% BSA封閉的微孔板中，37℃孵育30分鐘。陽(yáng)性對(duì)照孔加200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50μL與生理鹽水50 μL混合，陰性對(duì)照孔加生理鹽水100 μL。加入1%洗滌O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞20 μL/孔，37℃孵育1 h。生理鹽水洗滌3次。加入10 μg/mL熒光抗體 FITC-標(biāo)記山羊抗人IgG Fc （ab）2 100 μL/孔，37℃避光孵育30 min。生理鹽水洗滌3次。最后一次洗滌后扣干，加生理鹽水300μL/孔稀釋。流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）”表示，P＜0.001表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 多肽理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原性 生理鹽水溶解后，Peptide 1呈弱混濁狀，超聲波助溶后溶解。Peptide 3呈強(qiáng)膠凍狀。Peptide 2、Peptide 4溶于生理鹽水。Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4的等電點(diǎn)值為6.71～10.00；親水性由強(qiáng)至弱依次為Peptide 3＞Peptide 1＞Peptide 2＞Peptide 4；在不穩(wěn)定性方面，Peptide 4最為穩(wěn)定（32.42），而Peptide 3最不穩(wěn)定（48.63）；無規(guī)則卷曲與抗原性均未在Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4中形成。

2 多肽驗(yàn)證 在微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡中Peptide 3因呈強(qiáng)膠凍狀不能通過微柱凝膠，未表現(xiàn)出明顯陰陽(yáng)反應(yīng)。隨著噬菌體多肽濃度增加，Peptide 1、Peptide 2、Peptide 4對(duì)IgG型單克隆抗-D與O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞的凝集有一定劑量效應(yīng)，其中Peptide 4劑量效應(yīng)最為明顯（圖1）。

表2 有效多肽理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原性特征比較

3 多肽有效遮蔽濃度 當(dāng)Peptide 4濃度為1 mg/50 μL時(shí)，其對(duì)IgG型單克隆抗-D和RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)有一定的抑制效果，但仍有少量凝集；當(dāng)Peptide 4濃度為2 mg/50 μL時(shí)，其抑制IgG型單克隆抗-D和RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的效果較為明顯，接近陰性對(duì)照（圖2）。

4 多肽遮蔽效果 陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度分別為180.9±3.4、586.0±4.8（n＝8）。Peptide 4遮蔽后熒光強(qiáng)度為190.7±3.5（n＝3），與陽(yáng)性對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與陰性對(duì)照相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.1373）（圖3）。

討 論

RhD抗原是除ABO血型抗原外最具免疫性的紅細(xì)胞抗原。近年來，通過將生物化學(xué)與化學(xué)、材料科學(xué)、臨床輸血醫(yī)學(xué)結(jié)合，使用化學(xué)材料修飾改造紅細(xì)胞血型抗原的研究結(jié)果[7，8]，為制備無血型抗原的通用型紅細(xì)胞，降低因血型不合所致的輸血反應(yīng)，提高輸血的安全性，進(jìn)行了富有創(chuàng)新性的探討。用于RhD抗原化學(xué)修飾的大分子化學(xué)材料主要是聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）及其衍生物，但其有效性和安全性有待深入研究。

多肽因其功能明確、特異性高、副作用小、生產(chǎn)成本低等特性已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和診斷試劑中[9-11]。其在高靈敏檢測(cè)分析、診斷、蛋白質(zhì)相互作用、抗感染新藥研發(fā)及難治性病毒感染性疾病（如AIDS、HBV、HSV、Rabies virus等）與癌癥治療等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。多肽抗原易于制備、特異性強(qiáng)，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，易于臨床應(yīng)用，可以彌補(bǔ)抗體在診斷領(lǐng)域中的不足，是理想的檢測(cè)及治療的材料。目前運(yùn)用多肽抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)的試劑有甲肝、乙肝、丙肝、庚肝等肝病病毒以及艾滋病病毒等[12-16]。本研究根據(jù)噬菌體表面展示技術(shù)篩選得到的陽(yáng)性噬菌體氨基酸序列合成4條RhD噬菌體多肽[6]，從特異性、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等多方面進(jìn)行深入研究。

多肽具有廣泛的溶解性，但多肽紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于多肽的溶解。合適的多肽溶解方法是多肽實(shí)驗(yàn)成功的重要因素。不合適的溶解會(huì)造成多肽的損失和實(shí)驗(yàn)的失敗，然而尋找理想的溶解方法有時(shí)具有相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)性。多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性，其溶解原理為：酸性的多肽溶解于堿性溶液，而堿性多肽可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機(jī)溶劑中，如二甲

基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加蒸餾水稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因?yàn)镈MSO可能造成側(cè)鏈氧化。Peptide 1、Peptide2均為強(qiáng)堿性多肽（等電點(diǎn)值為10.00），Peptide 3、Peptide 4為酸性多肽（等電點(diǎn)值分別為6.71、6.74）。堿性多肽可先嘗試用蒸餾水溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%～25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，可添加少量不飽和脂肪酸（Tallow Fatty Acid，TFA）（10～50）μL增溶，如果多肽一點(diǎn)都不溶，可用DMSO并以超聲波助溶，最后用水稀釋至理想濃度。酸性多肽也可先嘗試用蒸餾水溶解；如果不溶于水，加入NH4OH（＜50 μL）助溶，并用去離子水稀釋至1 mL。然而，紅細(xì)胞膜滲透脆性大，凝集實(shí)驗(yàn)時(shí)需要充分考慮用于溶解多肽的溶劑是否會(huì)破壞紅細(xì)胞，影響結(jié)果判讀，而上述蒸餾水以及有機(jī)溶劑均不適用于紅細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。本研究采用生理鹽水溶解多肽，但在陽(yáng)性噬菌體狀態(tài)表現(xiàn)出明顯特異性的氨基酸序列[6]，在合成噬菌體多肽Peptide 3后卻不溶于生理鹽水，呈強(qiáng)膠凍狀，嚴(yán)重影響多肽的驗(yàn)證試驗(yàn)。分析多肽不溶的主要原因是形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而鹽更會(huì)促進(jìn)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成。

4條RhD噬菌體多肽總平均疏水指數(shù)均為負(fù)數(shù)，分別為-0.850、-0.683、-1.358、-0.050，表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。在抗原、抗體結(jié)合的過程中，多肽完整而穩(wěn)定的空間立體構(gòu)象是決定能否穩(wěn)定結(jié)合的重要因素。Peptide 1、Peptide 4不穩(wěn)定指數(shù)值分別為38.87、32.42，為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)＜40）?？乖灶A(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示4條多肽均無抗原性，可避免經(jīng)此多肽輸入人體后產(chǎn)生針對(duì)該多肽的抗體，對(duì)本研究的目的而言是有利的（表2）。

微柱凝膠法檢測(cè)血型的原理是：經(jīng)過離心，未凝集的紅細(xì)胞可通過凝膠的分子篩，到達(dá)凝膠底部，判斷為陰性；而凝集的血塊體積增大不能順利通過凝膠的分子篩，根據(jù)凝塊的大小所達(dá)到凝膠柱的位置不一樣，從而可判斷陽(yáng)性的強(qiáng)弱。Peptide 3因呈強(qiáng)膠凍狀而凝結(jié)于微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡上層，紅細(xì)胞被不能充分溶解的噬菌體多肽阻擋，不能通過微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡的凝膠，影響了結(jié)果的判斷。Peptide 1、Peptide 2隨著濃度增加，IgG型單克隆抗-D與紅細(xì)胞反應(yīng)凝集程度減少，凝塊有所減小，但遮蔽效果并不太理想。Peptide 4表現(xiàn)出抑制IgG型單克隆抗-D與RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的劑量效應(yīng)，但多肽濃度為1.0 mg/50 μL時(shí)仍未達(dá)到完全抑制（圖1）。

顯微鏡觀察可見，Peptide 4遮蔽濃度為1 mg/50 μL時(shí)，IgG型單克隆抗-D與RhD抗原的反應(yīng)仍有少量凝集；當(dāng)遮蔽濃度增加至2 mg/50 μL時(shí)，其抑制IgG型單克隆抗-D與RhD抗原的反應(yīng)效果較為明顯（圖2）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照相比，2.5 mg/50 μL濃度的Peptide 4對(duì)IgG型單克隆抗-D與O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞的凝集具有抑制作用（圖3），達(dá)到了遮蔽效果。

本研究初步體現(xiàn)了RhD噬菌體多肽免疫遮蔽抗-D與RhD抗原反應(yīng)的應(yīng)用價(jià)值和潛在的應(yīng)用前景，為今后RhD蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究及抗原性改造等做出一定的理論探索。然而，對(duì)于已產(chǎn)生大量抗-D抗體的個(gè)體，此多肽的遮蔽效果還有待提高，以減少個(gè)體輸入量。多肽作為藥物輸入人體后，也可能會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的變化從而影響其穩(wěn)定性和特異性，如何計(jì)算輸入量達(dá)到理想的遮蔽效果等許多問題需進(jìn)一步深入研究。