李麗瑋 于建 李興龍 鐘寧 嚴(yán)賽 楊燕 嚴(yán)錢勤 丁在咸 李志強(qiáng)

隨著獸醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展，犬類長期受人類馴化，生長環(huán)境和人類較為相近，加上其體型合適，已成為多種疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型廣泛用于生命醫(yī)學(xué)研究[1-4]。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)因血小板數(shù)量或/和功能減少導(dǎo)致的出血，為了延長實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型觀察期往往需要輸注血小板。由于受到諸多因素限制，實(shí)驗(yàn)犬間即刻輸注新鮮血小板有時(shí)很難實(shí)現(xiàn)，能否在緊急情況下輸注深低溫保存血小板從而延長實(shí)驗(yàn)犬生存期、以及實(shí)驗(yàn)犬血小板深低溫保存前后相關(guān)參數(shù)的變化等研究國內(nèi)外報(bào)道甚少。因此，為了明確實(shí)驗(yàn)犬血小板深低溫保存前后變化，筆者選擇比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對象，進(jìn)行不同濃度二甲亞砜實(shí)驗(yàn)犬血小板深低溫保存前后相關(guān)參數(shù)變化研究，旨在為實(shí)驗(yàn)犬安全、及時(shí)和有效的輸血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

1 動(dòng)物來源 雄性比格犬購自上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)場，SCXK（滬）2017-0007，皆由上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物房提供飼養(yǎng)（SPF級，質(zhì)量合格證號(hào)：NO.201705569），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（滬）2016-0020。

2 主要試劑耗材與設(shè)備

2.1 試劑：血細(xì)胞分析用稀釋液（CELLPACK）（濟(jì)南希森美康醫(yī)用電子有限公司，批號(hào)：G7164），血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)⊿TROMATOLYSER-4DL）（希森美康生物科技（無錫）有限公司，批號(hào)：R7030），血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)⊿ULFOLYSER）（SYSMEX CORPORATION，批號(hào)：A6001），血細(xì)胞分析用染色液（STROMATOLYSER-4DS）（SYSMEX CORPORATION，批號(hào)：A7032），清洗液（CELLCLEAN）（SYSMEX CORPORATION，批號(hào)：A7001）。血小板糖蛋白-Ib、血小板選擇素、血小板因子-4、β-血小板球蛋白檢測試劑（上海篤瑪生物科技有限公司，批號(hào)依次為：180725C、180815B、180810A、180813B）等。

2.2 耗材：一次性使用塑料血袋（上海輸血技術(shù)有限公司，注冊證編號(hào)：國械注準(zhǔn)20153661020，生產(chǎn)許可證號(hào)：滬食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20000466號(hào)），含輸血用1號(hào)抗凝液28mL。

2.3 設(shè)備：Sysmex自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex株式會(huì)社制造，型號(hào)：XE21OO）；酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司，Infinite F50型）、離心機(jī)（湖南湘儀股份有限公司，TG16-W型）等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 血液采集：比格犬16只，應(yīng)用戊巴比妥鈉麻醉后各放血400 mL至血袋中，每袋200 mL。

3.2 制備冰凍血小板：利用無菌導(dǎo)管連接器將血袋與200 mL轉(zhuǎn)移袋相連接。將200 mL血袋在（4±2）℃、2500 g離心12 min后，分離出血小板懸液。在無菌條件下，將盛有血小板懸浮液袋置于水平振蕩振蕩儀上輕輕晃動(dòng)（60-80次/min），同時(shí)按2%或5%二甲基亞楓（DMSO）比例使用無菌注射器緩慢注入（1 mL/min）盛有血小板懸浮液袋中，使DMSO與血小板懸液充分混勻后分裝成5袋并標(biāo)記，將盛有血小板懸浮液袋厚度控制在3-5 cm，平置放于-80℃低溫儲(chǔ)血冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 制備冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞：將冰凍血小板從-80℃低溫儲(chǔ)血冰箱中取出，立即水平置于42℃水浴中使其快速融化至液體狀態(tài)后取出。

3.4 檢測項(xiàng)目與方法：在冰凍前、冰凍第1天（1 d）、冰凍第35天（35 d）、冰凍第60天（60 d）、冰凍第90天（90 d）、冰凍第180天（180 d）分別進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板選擇素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）相關(guān)檢測。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照各檢測項(xiàng)目操作規(guī)程實(shí)施。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s） 表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板常規(guī)參數(shù)變化 2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前PLT、PCT分別與冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前MPV、PDW分別與冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT分別相互間比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1d的MPV、PDW、PCT分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d的MPV、PDW、PCT分別相互比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT、PCV、MPV、PDW分別與5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2 血小板生化參數(shù)變化 2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后1 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；冰凍后35 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后60 d、90 d、180 d比較差異均有意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后60 d GP-Ⅰb、PF4分別與冰凍后90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而冰凍后60 d的P-Selectin、β-TG分別與冰凍后90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后90 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后180 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TGP分別與5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 不同濃度二甲亞砜深低溫保存實(shí)驗(yàn)犬血小板常規(guī)參數(shù)變化

表2 不同濃度二甲亞砜深低溫保存實(shí)驗(yàn)犬血小板生化參數(shù)變化

討 論

為了最大限度提高實(shí)驗(yàn)犬的生存率[5]，及時(shí)給實(shí)驗(yàn)犬輸血是一種重要的治療手段。然而，犬間輸血的血源十分匱乏[6-7]，尤其是對血小板數(shù)量減少或/和功能低下伴有嚴(yán)重出血傾向的實(shí)驗(yàn)犬，是否可像人類一樣在緊急情況時(shí)輸注血小板，從而延長其生存期的國內(nèi)外報(bào)道甚少。目前國內(nèi)對血小板數(shù)量減少或/和功能低下伴有嚴(yán)重出血傾向患者，通常輸注保存期5天血小板。然而，諸多原因?qū)е挛覈“骞┬杳苁滞怀觥Ｒ虼?，部分?yán)重出血患者在無保存期5天血小板前提下，也接受5%二甲亞砜制備冰凍血小板緊急輸注，起到了一定的止血效果，挽救了患者的生命[8-12]。

涉及血小板相關(guān)功能與因子參數(shù)主要包括：血小板計(jì)數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板選擇素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）等。其中GP-Ib是膠原、凝血酶、血管性假性血友病因子、纖維蛋白原和二磷酸腺苷等受體的成分，參與血小板黏附、聚集和活化反應(yīng)，是生理性止血和病理性血栓形成的重要部分。P-Selectin主要分布于血小板α顆粒及內(nèi)皮細(xì)胞的棒狀（Weibel-Palade）小體；當(dāng)血小板及內(nèi)皮細(xì)胞受到凝血酶、組胺、補(bǔ)體、氧自由基等刺激后迅速與質(zhì)膜融合而在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，啟動(dòng)了血小板與內(nèi)皮細(xì)胞間以及相關(guān)細(xì)胞與白細(xì)胞的相互黏附，也參與血栓形成的病理過程。PF4是由血小板α顆粒合成的一種特異蛋白質(zhì)，是一種堿性多肽的四聚體；易結(jié)合并中和肝素，也易結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素上，以減慢凝血酶滅活過程，從而促進(jìn)血栓形成。β-TG是一種血小板特異性球蛋白，在誘導(dǎo)劑刺激下由血小板α顆粒釋放至血漿中，可反映血小板特異的釋放功能。因此，為了進(jìn)一步明確深低溫保存對實(shí)驗(yàn)犬血小板的影響必須進(jìn)行相關(guān)功能參數(shù)研究，為實(shí)驗(yàn)犬安全、及時(shí)和有效輸血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

二甲亞砜（DMSO）是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，在深低溫（-200℃）保存細(xì)胞時(shí)，能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，避免細(xì)胞損傷的發(fā)生。因此，DMSO是目前最常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑。然而，DMSO也存在一定的毒性作用，與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生作用可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，具有血管毒性和肝腎毒性。6%DMSO于-80℃進(jìn)行血小板冰凍保存，可使其保質(zhì)期由7天延長至2年[13]，而該濃度下冷凍后的犬血小板活性有所降低[14]。另外，有研究結(jié)果表明，5%DMSO于-80℃進(jìn)行血小板冰凍保存后，會(huì)導(dǎo)致血小板微粒表面受體表型發(fā)生變化，改變其中肌動(dòng)蛋白、細(xì)絲蛋白、原肌球蛋白的表達(dá)[15]。因此，本研究在應(yīng)用常規(guī)5%DMSO進(jìn)行血小板冰凍保存研究，同時(shí)嘗試使用低濃度DMSO（2%）進(jìn)行犬血小板冰凍保存研究，其目的在于為了盡量避免實(shí)驗(yàn)犬在輸注冰凍血小板后，由于殘留DMSO導(dǎo)致臨床動(dòng)物試驗(yàn)各種結(jié)果的不確定性。

本研究結(jié)果表明應(yīng)用2%二甲亞砜濃度和5%二甲亞砜濃度分別深低溫保存血小板，其保存前后PLT、PCT、GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG變化均不明顯（P＞0.05）；而MPV、PDW則有不同程度變化（P＜0.05）。隨著深低溫保存血小板時(shí)間的延長，在1-180d內(nèi)除PLT外MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分別均有不同程度增高。筆者認(rèn)為在180天內(nèi)應(yīng)用2%和5%二甲亞砜濃度對實(shí)驗(yàn)犬血小板進(jìn)行深低溫保存，隨著保存時(shí)間的延長，血小板相關(guān)因子促凝活性沒有明顯減弱趨勢。另外，2%二甲亞砜濃度進(jìn)行深低溫保存血小板的PLT、MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分別與5%二甲亞砜濃度進(jìn)行深低溫保存血小板比較無明顯區(qū)別（P＞0.05）。因此，筆者認(rèn)為為了減少殘留DMSO量導(dǎo)致臨床動(dòng)物試驗(yàn)各種結(jié)果影響，在遇到實(shí)驗(yàn)犬因血小板因素引起的出血可推薦應(yīng)用2%二甲亞砜濃度深低溫保存血小板。