臧艷 葉辛 錢寶華

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是臨床上最常見的出血性疾病之一，其病理特點是患者產(chǎn)生針對自身血小板的抗體，導致血小板破壞增多及生成障礙。常見的臨床表現(xiàn)為皮膚瘀點瘀斑，嚴重者可出現(xiàn)難以控制的內(nèi)臟和頭顱出血，嚴重危害患者的生命健康[1]。與大部分自身免疫性疾病相似，自身免疫穩(wěn)態(tài)的失衡是導致疾病的關鍵因素，其中眾多的免疫細胞均參與該過程，如自反應性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、B細胞及單核細胞等[2]。目前多數(shù)研究認為T細胞功能紊亂在ITP的發(fā)病中起到?jīng)Q定性作用[3]，具體來說就是Th17亞型細胞的過多激活[4]，導致患者自身免疫亢進。

CD200是一種Ⅰ型膜糖蛋白，廣泛表達于多種細胞與組織中，通過與其結(jié)構(gòu)相似的受體CD200R1來傳遞影響多種生理系統(tǒng)的應答信號。與CD200不同，其受體CD200R1的表達更局限于髓系和淋巴系的細胞中[5]。已經(jīng)有許多研究顯示，CD200參與了多種疾病的發(fā)病機制，包括腫瘤、過敏性疾病及自身免疫性疾病。研究表明，CD200/CD200R1信號在類風濕關節(jié)炎（RA）患者滑膜及外周血中存在表達量及功能的異常，參與了RA疾病的免疫調(diào)節(jié)及病理轉(zhuǎn)歸[6]。在另一種常見的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中也發(fā)現(xiàn)了CD200和CD200R1的信號異常，并參與了SLE疾病的免疫紊亂[7]。然而人們對于該信號通路分子是否在ITP疾病患者中表達異常以及是否與ITP的自身免疫紊亂有關仍不清楚。

基于上述研究進展，本研究擬探討ITP患者外周血PBMC中CD200及其受體CD200R1的表達情況，分析其與ITP患者Th1/17細胞亢進的關系，為深入理解ITP的發(fā)病機制提供新的實驗依據(jù)，并為可能的免疫調(diào)節(jié)治療方法提供潛在靶點。

材料與方法

1 研究對象 本研究共納入2014年9月～2016年5月上海長海醫(yī)院新診斷的ITP患者共19例，其中男性7例，女性12例，平均年齡51.2歲。所有患者均符合中華醫(yī)學會血液學分會關于ITP診斷達成的專家共識[8]。

與此同時，同期納入了與ITP患者組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義的19名健康體檢者為健康對照組。該研究通過上海長海醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署了書面知情同意書。

2 試劑與儀器 人淋巴細胞分離液（Sigma，P7794），TRIzol（Invitrogen，15596018），PrimeScript RT Master Kit（Takara，RR036A），TNF-α，IFN-γ及IL-17 ELISA試劑盒（R&D DTA00D，DIF50，D1700），Sysmex XT-2100L全自動血液分析儀，實時熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

3 方法

3.1 臨床標本收集：用枸櫞酸鈉抗凝采血管收集ITP患者組和健康對照組外周血各10 mL。

3.2 實時熒光定量PCR法檢測PBMC中CD200/CD200R1的表達量：首先采用Ficoll密度梯度離心法分離每個標本的PBMC，利用TRIzol法提取樣本總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄制備cDNA備用。采用SYBR Green嵌入染料法進行PCR擴增反應。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算CD200及CD200R1在ITP組和健康對照組中的相對表達量。

3.3 采用ELISA法檢測TNF-α，IFN-γ及IL-17的蛋白濃度：離心后取得血漿標本，按照試劑盒說明書步驟檢測TNF-α，IFN-γ及IL-17在血漿中的蛋白濃度。

4 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差的方式表達，兩組間的均數(shù)比較采用成組t檢驗或配對t檢驗，利用Spearman秩相關法進行相關性分析。檢驗水準設置為α=0.05，所有分析均為雙側(cè)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ITP患者PBMC中CD200及CD200R1表達量下調(diào)如圖1所示，與健康對照組相比，ITP患者PBMC中CD200及CD200R1的mRNA表達量均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t=36，P＜0.05；t=38，P＜0.05）。

2 ITP患者血漿中TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表達量上調(diào) 如圖2所示，與健康對照組相比，TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表達量在ITP患者組中均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t=33.11，P＜0.05；t=14.92，P＜0.05；t=37.16，P＜0.05）。

表1 CD200/CD200R1與ITP患者血小板計數(shù)的相關性分析

表2 CD200/CD200R1與TNF-α及IL-17表達量的相關性分析

3 ITP患者中CD200和CD200R1與血小板計數(shù)、TNF-α、IFN-γ及IL-17蛋白表達量的相關性分析如表1所示，CD200和CD200R1均與患者血小板計數(shù)間呈正相關。另如表2所示，ITP患者中CD200和CD200R1分別與TNF-α及IL-17的表達量間呈負相關。

4 監(jiān)測經(jīng)有效治療后ITP患者外周血PBMC中CD200/CD200R1的表達水平 共有11例患者經(jīng)地塞米松治療后，達到臨床完全緩解的標準。進一步采集了這11例患者完全緩解后的外周血PBMC標本。經(jīng)實時熒光定量PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，CD200/CD200R1的表達量較治療前均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.53，P＜0.000 1；t=7.225，P＜0.000 1）（圖3）。

討 論

目前，臨床上治療ITP的手段十分有限，大部分藥物治療只能做到緩解癥狀，難以根治[9]。其根本原因是疾病發(fā)病機制未完全闡明。雖然其病理表現(xiàn)僅為血小板減少導致患者出血風險增加，但其背后的機理十分復雜，涉及了復雜的免疫信號網(wǎng)絡調(diào)控，以及遺傳和環(huán)境的影響[10]。因此，深入研究ITP患者體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)失衡的具體機制具有重要的科學和臨床價值。

本研究首次發(fā)現(xiàn)CD200/CD200R1信號分子在ITP患者PBMC中表達異常，且與ITP患者的血小板計數(shù)的相關性有統(tǒng)計學意義。目前評價ITP患者臨床癥狀嚴重程度的指標十分有限，血小板計數(shù)是一個較直觀的指標?；颊哐“逵嫈?shù)越低時，直接反映血小板破壞過多及生成減少的狀態(tài)，而患者的凝血功能亦越低，出血癥狀及風險越重[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)CD200/CD200R1與患者的血小板計數(shù)正相關，說明CD200/CD200R1信號分子與ITP的疾病嚴重程度相關，未來可作為監(jiān)控ITP病情的潛在指標。

已有研究表明，T細胞免疫失調(diào)是ITP發(fā)病的關鍵因素，患者通常呈現(xiàn)Th1/17型細胞因子表達亢進，從而打破自身免疫耐受，產(chǎn)生自身抗體，導致疾病。CD200/CD200R1分子可以抑制免疫系統(tǒng)的反應，維持外周的免疫耐受。有研究表明CD200-/-的RA疾病模型小鼠的病理進程顯著加速[12]。上調(diào)CD200的表達后RA疾病進展被延緩或完全停止。這一作用是通過影響細胞因子的生成實現(xiàn)的，其可以減低促炎性細胞因子的表達水平，如TNF-α、IL-1β、MMP-13及IFN-γ[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD200/CD200R1信號分子與TNF-α及IL-17的表達水平呈負相關，說明ITP患者中低表達的CD200/CD200R1可以使促炎性細胞因子TNF-α及IL-17的表達水平升高，加重患者的病理狀態(tài)。該結(jié)果與之前研究發(fā)現(xiàn)的ITP患者Th1/17亢進是相符的。

綜上所述，CD200/CD200R1的表達及功能在ITP患者的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，其可能通過減少炎性因子分子的表達發(fā)揮抑制作用，調(diào)控患者的疾病進程。本研究結(jié)果為未來評估ITP患者疾病狀態(tài)及靶向性免疫治療提供了新的潛在靶點和實驗依據(jù)。