王靜 榮柏洋 ?；?朱文凱 趙志鵬 謝建軍 胡曼青

肺炎球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)常見(jiàn)的病原微生物。CAP與心血管并發(fā)癥的短期和長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1]。常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥包括急性心肌梗死、新發(fā)心律失常和心力衰竭等。重癥肺炎、高齡和既往心血管疾病病史是出現(xiàn)心臟并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，PLY)具有膽固醇結(jié)合活性，是肺炎球菌的主要蛋白質(zhì)毒力因子。PLY在心肌細(xì)胞損傷和CAP相關(guān)心血管事件中起關(guān)鍵作用。PLY可能通過(guò)直接細(xì)胞毒性和間接促炎及促血栓形成作用，成為引起心肌細(xì)胞損傷的關(guān)鍵介質(zhì)[2]。本文就近年來(lái)對(duì)PLY的生物活性、引起心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制及防治策略予以探討。

PLY的生物活性

PLY由471個(gè)氨基酸組成，分子量53kDa，是肺炎球菌的主要蛋白質(zhì)毒力因子，含有四個(gè)不連續(xù)的功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域1～3共同賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)域4包含細(xì)菌膽固醇依賴性溶細(xì)胞素(bacterial cholesterol-dependent cytolysin，CDC)家族所有成員，介導(dǎo)PLY與真核細(xì)胞膜結(jié)合[3]。PLY位于肺炎球菌細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)自溶機(jī)制或經(jīng)β-內(nèi)酰胺類抗生素作用后釋放出來(lái)。與其他細(xì)菌CDC不同，由于缺乏典型的N末端信號(hào)分泌前導(dǎo)序列，PLY不被肺炎球菌主動(dòng)分泌。在某些血清型肺炎球菌的細(xì)胞壁中檢測(cè)到PLY的活性形式，取決于跨膜輔助分泌系統(tǒng)SecY2A2因子的活性，有利于增強(qiáng)細(xì)菌侵襲力和維持持續(xù)感染[4]。

PLY是一種重要的成孔毒素?？捉Y(jié)構(gòu)形成依賴結(jié)構(gòu)域4的疏水附著區(qū)與真核細(xì)胞膜膽固醇頭部基團(tuán)的相互作用。結(jié)構(gòu)域4中L1環(huán)中的蘇氨酸-亮氨酸與膽固醇結(jié)合后，十一肽序列穿插入膜中，形成毒素寡聚化單體。經(jīng)過(guò)中間預(yù)孔的自組裝，最終形成由42個(gè)毒素單體組成，最大直徑為400A的跨膜管孔[5]。在高濃度下，PLY誘導(dǎo)細(xì)胞膜不可逆的孔結(jié)構(gòu)形成，造成細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，K+外流，膜去極化和細(xì)胞高反應(yīng)性，導(dǎo)致多種類型的細(xì)胞溶解。包括紅細(xì)胞、血小板、先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞、心肌細(xì)胞和各種類型上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。不同細(xì)胞對(duì)PLY溶細(xì)胞作用的敏感性有所差異。PLY的細(xì)胞毒活性引起免疫抑制和組織損傷，有利于肺炎球菌肺外傳播和持續(xù)感染。在亞致死濃度下，由于PLY誘導(dǎo)形成的孔結(jié)構(gòu)短暫而可逆，對(duì)于先天免疫系統(tǒng)和血小板，可能引起促炎和促血栓形成作用的過(guò)度活化[6]。

PLY引起心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制

一、PLY的直接心臟毒性

心血管事件是CAP常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，發(fā)生率高達(dá)30%。CAP患者出現(xiàn)心血管并發(fā)癥使CAP相關(guān)30天的死亡率增加了5倍，并與出院后長(zhǎng)期死亡率增加和心血管事件復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在感染肺炎球菌TIGR4或D39菌株的實(shí)驗(yàn)小鼠，PLY參與了對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)腹膜接種或氣道途徑感染肺炎球菌，感染后12～30小時(shí)內(nèi)小鼠血液中細(xì)菌數(shù)量呈線性增加。隨后出現(xiàn)心電圖動(dòng)態(tài)變化及循環(huán)心肌肌鈣蛋白-I濃度持續(xù)增加，表明存在心肌細(xì)胞損傷和功能異常?；罱M織分析顯示，心肌細(xì)胞中存在微小病變，病變心肌包含肺炎球菌聚集體和少量炎癥細(xì)胞，這在肺炎球菌TIGR4菌株感染中最為明顯。另外，通過(guò)眼眶后靜脈竇注射重組PLY，在心臟微血管系統(tǒng)引起明顯損傷和炎癥跡象。同樣的微小病變并未在肝臟、脾臟或腎臟中檢測(cè)到，表明PLY可能具有嗜心肌細(xì)胞毒性作用[8]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，基于肺炎球菌CbpA基因，采用小鼠磷酸膽堿結(jié)合血小板活化因子引起受體基因失活，用重組CbpA預(yù)先免疫小鼠可起到保護(hù)作用，表明PLY參與了心肌細(xì)胞侵襲。此外，通過(guò)敲除病原體的PLY基因，以及通過(guò)用PLY疫苗預(yù)先免疫小鼠，使PLY的成孔活性減弱，可減輕心肌細(xì)胞的微小損傷；在體外實(shí)驗(yàn)也觀察到易感心肌細(xì)胞易受PLY的細(xì)胞毒作用的影響。這些實(shí)驗(yàn)支持PLY在介導(dǎo)心肌細(xì)胞直接損傷的證據(jù)，涉及免疫靜息和促凋亡機(jī)制等方面。

二、PLY的間接促炎及促血栓形成作用

肺炎球菌肺炎是CAP患者急性心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。侵襲性肺炎球菌感染與明顯的血小板活化和高反應(yīng)性相關(guān)[9]。血小板是急性心血管事件的關(guān)鍵細(xì)胞，血小板高反應(yīng)性可能導(dǎo)致肺炎球菌感染患者血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加。血小板在急性心血管事件和動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用。并發(fā)心肌梗死的CAP患者血小板活化血漿標(biāo)志物增加。肺炎球菌對(duì)血小板的直接刺激誘導(dǎo)明顯的血小板活化和高反應(yīng)性，模型豬洗滌血小板在體外暴露于肺炎球菌可被激活。肺炎球菌除了通過(guò)與血小板Toll樣受體(TLR)-2，F(xiàn)cγRIIA和整合素αIIbβ3結(jié)合，直接激活血小板外，也可通過(guò)PLY誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和血小板促炎及促血栓形成作用，間接參與嚴(yán)重肺炎球菌感染期間心肌細(xì)胞的損傷過(guò)程[10]。另外，PLY介導(dǎo)的亞裂孔形成和Ca2+的流入，進(jìn)一步引起暴露于PLY的血小板和中性粒細(xì)胞活化，并導(dǎo)致前粘附整合素GPIIb/IIIa以及CD62P的表達(dá)上調(diào)，分別誘導(dǎo)同型血小板聚集及中性粒細(xì)胞與血小板相互聚集。血小板誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞過(guò)度活化，促進(jìn)各種血栓形成，發(fā)揮聯(lián)結(jié)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁作用[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞暴露于純化PLY中，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NET)作用。在誘導(dǎo)NET形成過(guò)程中，核小體進(jìn)一步濃縮，衍生出新生蛋白質(zhì)顆粒，通過(guò)高遷移率族蛋白B1呈遞，外排到細(xì)胞外，加強(qiáng)中性粒細(xì)胞貼壁血小板。同時(shí)，肺炎球菌進(jìn)入血循環(huán)后，產(chǎn)生血管內(nèi)宿主先天免疫應(yīng)答。若免疫應(yīng)答失控，易在冠狀動(dòng)脈內(nèi)形成血栓的潛在危險(xiǎn)[12]。NET也可通過(guò)表達(dá)組織因子，結(jié)合和活化血小板，激活內(nèi)在凝血系統(tǒng)，并使內(nèi)源性抗凝血因子失活，進(jìn)而促進(jìn)血栓形成。NET激活動(dòng)靜脈血管內(nèi)凝血后，可增加血栓脫落和動(dòng)脈直接閉塞的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致心肌缺血，甚至心肌梗塞[13]。

關(guān)于PLY靶向治療策略的最新進(jìn)展

近年來(lái)，臨床開(kāi)展了一系列針對(duì)PLY的靶向治療，例如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的靶向抗炎活性，CDC-多價(jià)螯合脂質(zhì)體，全人源化毒素中和單克隆抗體的早期臨床評(píng)價(jià)。取得了初步的治療效果。

對(duì)于肺炎球菌CAP患者，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除了主要的抗菌作用外，還有獨(dú)特的中性粒細(xì)胞靶向抗炎活性[2]。有研究比較了ICU嚴(yán)重肺炎球菌CAP患者，不同抗生素聯(lián)合和不同給藥時(shí)間對(duì)死亡率的影響。結(jié)果顯示，接受β-內(nèi)酰胺單藥治療或β-內(nèi)酰胺/大環(huán)內(nèi)酯聯(lián)合治療的患者死亡率分別為13.8%和1.8%(P<0.001)。研究認(rèn)為，大環(huán)內(nèi)酯類靶向抑制細(xì)菌50S核糖體，與肽鏈末端結(jié)合并干擾肽鏈延伸，減弱PLY和其他細(xì)菌蛋白毒素的合成，減輕繼續(xù)使用β-內(nèi)酰胺抗生素潛在有害的過(guò)度炎癥反應(yīng)[14]。因此，聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療比接受單藥治療，可以明顯降低肺炎球菌CAP患者的死亡率。這與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過(guò)雙重作用機(jī)制，對(duì)抗PLY的毒性作用有關(guān)。另外，嚴(yán)重CAP患者，給予β-內(nèi)酰胺抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類聯(lián)合，給藥時(shí)間和順序可能影響臨床效果。對(duì)于肺炎球菌CAP，β-內(nèi)酰胺抗生素用藥之前給予大環(huán)內(nèi)酯類獲益更大，大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)中性粒細(xì)胞的靶向抗炎活性可能僅在β-內(nèi)酰胺類藥物給藥前最為顯著。因此，研究建議，聯(lián)合用藥時(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類應(yīng)首先輸注，隨后再給予β-內(nèi)酰胺抗生素，聯(lián)合用藥時(shí)間最好在2小時(shí)左右[15]。

對(duì)CDC-多價(jià)螯合脂質(zhì)體也進(jìn)行了相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和早期臨床評(píng)估。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的脂質(zhì)體為含有1：1膽固醇/鞘磷脂(66mol%膽固醇)的混合物，靜脈內(nèi)以100 mg/kg體重的劑量預(yù)處理小鼠，可以顯著減輕實(shí)驗(yàn)性IPD小鼠的心肌細(xì)胞損傷，對(duì)抗細(xì)菌成孔毒素的有害影響[16]。早期臨床評(píng)估的脂質(zhì)體CAL02為非抗生素脂質(zhì)體藥物，可中和PLY，防治嚴(yán)重感染和并發(fā)癥，提高抗生素療效。該藥物已經(jīng)完成嚴(yán)重肺炎球菌CAP的初步安全性評(píng)價(jià)，符合設(shè)計(jì)的安全性和耐受性指標(biāo)。13例入組的重癥CAP患者中，低劑量組有1例死于研究藥物無(wú)關(guān)的合并癥，其他12例患者均達(dá)到臨床治愈。連續(xù)器官功能障礙評(píng)分CAL02組平均降低65.0%,安慰劑組為29.2%(P<0.01)。該研究結(jié)果為繼續(xù)對(duì)CAL02進(jìn)行深入臨床研究提供了基礎(chǔ)[17]。

另外，基于PLY中和單克隆抗體(monoclonal antibodies，MAbs)治療策略的實(shí)驗(yàn)研究也在進(jìn)行中。初步研究表明，用致死劑量的肺炎球菌經(jīng)鼻腔感染小鼠，給予PLY中和抗體后，小鼠平均存活時(shí)間顯著增加[18]。ASN100是細(xì)菌成孔毒素的靶向治療抗體，包含兩種完全人源化的單克隆抗體ASN-1和ASN-2，基于MAbs的PLY靶向免疫療法可作為抗生素的輔助手段，通過(guò)中和細(xì)菌毒素和毒力因子以殺死細(xì)菌或減弱細(xì)菌的病理活性，用于預(yù)防ICU入院的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎高?；颊?。而Arsanis開(kāi)發(fā)的抗肺炎球菌MAbs(ASN400)的實(shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行中，等待研究結(jié)果的最終揭示[19]。

綜上所述，PLY是肺炎球菌的主要蛋白質(zhì)毒力因子，在肺炎球菌CAP的發(fā)病機(jī)制中起發(fā)揮重要作用。PLY介導(dǎo)的直接心肌細(xì)胞毒性和間接促炎及促血栓形成作用，參與心肌細(xì)胞損傷和功能障礙。PLY的靶向治療策略，目前處于評(píng)估的臨床前階段，可能會(huì)對(duì)嚴(yán)重肺炎球菌CAP患者的抗生素輔助治療策略產(chǎn)生重大影響。