崔勝男 邢秀菊

肺癌是一種惡性腫瘤，長時(shí)間吸煙及不良的飲食習(xí)慣會(huì)導(dǎo)致肺癌的形成，根據(jù)大數(shù)據(jù)顯示：全球肺癌患者的死亡率超過160萬人，并逐年遞增[1-2]。我國肺癌患者無論是疾病新增率還是死亡率多高于世界水平。肺癌患者早期時(shí)很難被發(fā)現(xiàn),無明顯特異性,所以在確診時(shí)已處于中晚期[3]。目前手術(shù)及放化療是肺癌患者臨床治療方法之一，但放化療過程中帶給患者強(qiáng)烈的刺激作用，患者出現(xiàn)心理和身體上的不適，產(chǎn)生排斥情緒，治療效果受到影響[4]。

苦參堿(matine)是從豆科植物提取的生物堿類，苦參是其中主要成分之一，在抑制炎癥、抵抗病毒方面具有重要作用。幾年來在廣譜抗腫瘤的作用中備受關(guān)注[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的肝癌及白血病小鼠體內(nèi)具有明顯的抗癌作用,并且無化學(xué)藥物的不良作用[6]。Wnt通路表達(dá)異常發(fā)生在多種腫瘤疾病當(dāng)中，肺癌是其中一種。大量數(shù)據(jù)表明，在肺癌細(xì)胞中觀察到APC蛋白及β連環(huán)蛋白發(fā)生改變是通過Wnt激活，完成傳到作用，但是具體的作用機(jī)制還不能完全清楚，通過阻斷Wnt信號(hào)的激活是否能夠作為治療惡性腫瘤疾病的治療策略還有待考察[7-8]。所以本文通過探討苦參堿對(duì)肺癌H466細(xì)胞凋亡有何影響及苦參堿是否能夠抑制Wnt信號(hào)通路傳到，做出研究分析。

資料與方法

一、材料、試劑和儀器

肺癌H466細(xì)胞株(上?；鄯f生物), 苦參堿( matrine) (上海源葉生物科)；Wnt-2(上海語燕生物科技)，鼠抗人β-catenin(上海麥倉科技), RPMI1640培養(yǎng)基(上海邦景),流式細(xì)胞儀(美國/BD， Accuri C6)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

將肺癌H466細(xì)胞放入RPMI 1640培養(yǎng)液中，常溫5%CO2，培養(yǎng)24h后，按照不同的細(xì)胞生長情況進(jìn)行定期傳代。

三、分組

按照每孔1×110個(gè)細(xì)胞數(shù)量均勻鋪于96孔板內(nèi),24h過夜,細(xì)胞的融合度達(dá)到70%時(shí),此時(shí),把體積為4μl脂質(zhì)體和體積為200μl緩沖液依次加入到無菌的EP管中,加入不同濃度的苦參堿。對(duì)照組為不加入苦參堿 ，低處理組加入0．5 g/L苦參堿。高處理組為2．0g /L苦參堿。

四、MTT法

三組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。放入20μLMTT(5 mg/mL)，4h培養(yǎng)后，去上清，加入100μL的DMSO，采用自動(dòng)熒光酶檢測吸光度值(A)抑制率%=(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)100%。

五、Hoechst33342-PI熒光雙染法

將三組細(xì)胞分別在蓋玻片的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，加入處理因素培養(yǎng)36h，在培養(yǎng)基內(nèi)加入少量Hoechst33342溶解溶液，濃度為10μL，37℃ 反應(yīng)15min。利用4%甲醛篤定細(xì)胞10min，在載玻片上滴入少量甘油，熒光顯微鏡下觀察。

六、流式細(xì)胞儀檢測肺癌細(xì)胞周期

三組H466細(xì)胞以2×110個(gè)/mL濃度置于96孔板，培養(yǎng)24h，4℃放置24h，離心15min，PBS洗滌5min，重復(fù)3次，加入70%乙醇l mL，再加入100μLRNA酶,用流式細(xì)胞儀分析三組細(xì)胞周期，分為G0/G1、S、G2/M期。

七、Western blot檢測

在6孔板中加入100μg的胰蛋白酶提取液,將細(xì)胞提取液放入EP管中,并與胰蛋白酶提取液按照1 ∶100進(jìn)行混合,再放入冰箱中冷凍10分鐘。使細(xì)胞完全裂變,成為E溶液;在EP管中放入H466細(xì)胞，并按照1 ∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 mL,使細(xì)胞完全裂變,成為F溶液;再把E和F溶液以80 ∶1的體積進(jìn)行搖勻,配制成工作液,放入37.5度的保溫箱中20分鐘,冷卻后計(jì)算Wnt蛋白質(zhì)的濃度。

八、qRT-PCR檢測β-cateninmRNA

在H466細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，離心15min，加異丙醇，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系：94℃15min，94℃15s，60℃34s，72℃10min，重復(fù)40次反轉(zhuǎn)錄體系，最后計(jì)算(見表1)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MTT檢測苦參堿對(duì)H466細(xì)胞活性的影響

MTT實(shí)驗(yàn)證明，低處理組的肺癌H466細(xì)胞活性低于無苦參堿的對(duì)照組(P<0.05)，高處理組的肺癌H466細(xì)胞活性低于低處理組，說明苦參堿對(duì)肺癌H466細(xì)胞具有抗腫瘤活性的作用(P<0.05)(見圖1)。

二、肺癌H466細(xì)胞的凋亡情況

對(duì)照組為正常的肺癌H466細(xì)胞呈藍(lán)色熒光表達(dá)的活細(xì)胞，低處理組發(fā)現(xiàn)H466細(xì)胞呈現(xiàn)早期凋亡并細(xì)胞核破碎形成凋亡小體凋亡程度高于對(duì)照組(P<0.05)，高處理組呈現(xiàn)紅色熒光的死細(xì)胞細(xì)胞凋亡率高于低處理組(P<0.05)(見圖2，3)。

*表示于對(duì)照組P<0.05;#表示于低處理組P<0.05

三、檢測H466細(xì)胞凋亡周期及凋亡率

H466細(xì)胞在苦參堿作用下，在G0/G1期細(xì)胞凋亡比例升高，S期下降，對(duì)照組于低處理組差異較小(P>0.05)，高處理組與低處理組、對(duì)照組有差異(P<0.05)，但在G2/M無明顯改變，G0/G1在高處理組凋亡率呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)(見表2)。

四、Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果：低處理組中的Wnt-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，與低處理組相比高處理組細(xì)胞中Wnt-2中表達(dá)最低(P<0.05)(見圖4，5)。

*表示與對(duì)照組P<0.05；#表示與低處理組P<0.05

*表示于對(duì)照組P<0.05;#表示于低處理組P<0.05

五、qRT-PCR檢測β-cateninmRNA

qRT-PCR顯示：低處理組細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，在高處理組細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)少于低處理組(見圖6，7)。

M表示Maker，1表示對(duì)照組；2表示低處理組；3表示高處理組。

*表示于對(duì)照組P<0.05;#表示于低處理組P<0.05

討 論

放化療治療肺癌患者產(chǎn)生的不良反應(yīng)較大，延長治療周期，對(duì)身體的傷害較為嚴(yán)重。中藥治療肺癌毒副作用少，優(yōu)勢(shì)較為突出[9]。目前，關(guān)于苦參堿抗腫瘤的研究較多，在對(duì)肝癌中，發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，并隨著藥物的作用時(shí)間及濃度增強(qiáng)，肝癌細(xì)胞的合成能力逐漸下降[10]，但是苦參堿對(duì)肺癌H466細(xì)胞有何作用，文獻(xiàn)尚少，本文通過苦參堿對(duì)肺癌H466的抑制作用及Wnt研究結(jié)果如下。

目前抗腫瘤的藥物對(duì)肺癌H466細(xì)胞的抑制方式有很多，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、分化和死亡。本文通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制肺癌H466細(xì)胞活性，濃度由小到大，肺癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及大面積死亡。說明苦參堿誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。張小文[11]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)苦參堿濃度分別為0.5g、1.0g及2.0g時(shí)，細(xì)胞凋亡的程度不斷增加，這說明苦參堿的誘導(dǎo)凋亡作用有濃度依賴性。其中的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制與卓新鳳[12]研究結(jié)果一致。本文研究表明正常肺癌H466細(xì)胞在免疫雙熒光中表現(xiàn)藍(lán)色，低處理組肺癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡并形成凋亡小體，高處理組出現(xiàn)大量肺癌細(xì)胞死亡，呈現(xiàn)熒紅色。盧迎宏[13]在體外增殖的肺癌A549細(xì)胞中加入苦參堿，肺癌細(xì)胞出自噬現(xiàn)象。Pu J[14]發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞內(nèi)加入2.0g苦參堿，肺癌停止分化出現(xiàn)分解。這與Chen SF[15]研究結(jié)果一致。通過流式細(xì)胞發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞在G0/G1周期時(shí)凋亡增對(duì)，并隨著苦參堿濃度升高而凋亡不斷增加。龐琪[16]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌能有減少增殖，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴性，在G0/G1細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)苦參堿明顯增加肺癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量。這與惠朋利[17]研究結(jié)果一致。

近些年來，Wnt信號(hào)通路在眾多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如在胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的異常變化具有重要參考價(jià)值。Wnt信號(hào)被激活時(shí)，靶器官的分化受到限制，干細(xì)胞特異性被保留，會(huì)加快肺癌細(xì)胞的分化，導(dǎo)致腫瘤形成。本文研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路在肺癌H466細(xì)胞中活性較高，并隨著苦參堿濃度的增加而活性降低。方彪彪[18]發(fā)現(xiàn)苦參堿抑制異常Wnt信號(hào)通路表達(dá)，能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并隨著濃度的增加而凋亡增多?？赡苁强鄥A干預(yù)后肺癌H466細(xì)胞產(chǎn)生分化成熟，Wnt信號(hào)通路減少表達(dá)，使肺癌H466細(xì)胞進(jìn)行成熟階段，Wnt信號(hào)通路會(huì)加快肺癌H466細(xì)胞的繁殖，這與An Q[19]研究結(jié)果一致。本文研究發(fā)現(xiàn)β-cateninmRNA在正常肺癌細(xì)胞內(nèi)活性升高，但是苦參堿增加會(huì)減少其表達(dá)，說明苦參堿抑制β-catenin活性。陸周一[20]研究表明苦參堿阻斷肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，可能與苦參堿抑制β-catenin活性有關(guān)，而達(dá)到改善肺癌病情的目的。

綜上所述：苦參堿可以加快肺癌H466細(xì)胞凋亡，在這過程中可能與阻斷Wnt信號(hào)通路傳達(dá)有關(guān)，苦參堿可以阻斷Wnt信號(hào)表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞分化。