劉豐進 孫斌 邱建清

百草枯理化性質(zhì)

百草枯(PQ)屬于一種季銨鹽除草劑，可經(jīng)消化道、呼吸道或破損的皮膚被人體不完全吸收導致中毒，其中口服是導致中毒的主要途徑。經(jīng)口進入體內(nèi)的百草枯在胃腸道吸收率為5～15%，約2小時后達到其血漿濃度的峰值，并通過血液循環(huán)造成多器官不同程度的損傷，其中以肺臟損傷為著，這可能與肺臟II型肺泡上皮細胞有關(guān)[1]。未被吸收的百草枯以糞便、尿液、乳汁等形式排出，尿液是其排出的最主要方式。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)在百草枯中毒大鼠模型中，其死亡率高達80%[2]。

百草枯中毒致肺纖維化形成機制

自百草枯問世以來，百草枯中毒導致肺纖維化的機制尚未闡明。目前認為其機制主要與氧化應(yīng)激損傷，線粒體損傷，炎癥反應(yīng)有關(guān)。

一、氧化應(yīng)激損傷

氧化應(yīng)激損傷是百草枯中毒導致肺纖維化的重要啟動機制[3]。百草枯具有較強的氧化性，在還原型輔酶II(NADPH)、一氧化氮合酶(NOS)等活性物質(zhì)的作用下被還原成自由基PQ+，自由基PQ+迅速與氧結(jié)合轉(zhuǎn)化為PQ2+和超氧陰離子(O2-)。O2-在超氧化物歧化酶(anti-oxidant enzymes，SOD)的催化作用下轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)，其在Fe2+的條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿鼜姷牧u自由基，羥自由基可參與體內(nèi)多種反應(yīng)，形成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS使SOD活性降低，與構(gòu)成細胞膜的主要成分-不飽和脂肪酸產(chǎn)生反應(yīng)，生成大量的脂質(zhì)過氧化物[4]，促使細胞凋亡，纖維細胞增生，導致肺纖維化。

二、線粒體損傷

線粒體是能量轉(zhuǎn)換的雙膜細胞器，在百草枯中毒致肺纖維過程中起到關(guān)鍵作用。百草枯進入人體細胞后利用相應(yīng)載體介質(zhì)和細胞膜的電位差穿過線粒體內(nèi)膜進入線粒體，被復(fù)合物I或NADPH脫氫酶降解，快速與氧氣反應(yīng)生成過多的超氧化物。超氧化物通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，同時也會導致線粒體的DNA損傷，使基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達異常[5]，加速了細胞壞死，促進肺纖維化。

三、炎癥反應(yīng)

百草枯中毒后產(chǎn)生的急性肺損傷，可迅速激活巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎性細胞在肺組織中聚集、浸潤、活化。在百草枯誘導的大鼠急性肺損傷實驗中，可發(fā)現(xiàn)中毒組大鼠炎性細胞較對照組明顯增加[6]?；罨难仔约毎ㄟ^復(fù)雜的信號通路產(chǎn)生促肺纖維化的細胞因子，其中包括與各種纖維化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。TGF-β在生物體中有3種不同形式的異構(gòu)體，TGF-β1在其中起到重要作用[7]。它能夠促進成纖維細胞不斷分裂、增殖，也加快成纖維細胞轉(zhuǎn)化為主要表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細胞[8]，并激活通路下游的結(jié)締組織生長因子(CTGF)[9]，誘導細胞外基質(zhì)(ECM)大量產(chǎn)生。并通過多種信號通路協(xié)同其他促纖維化細胞因子的生成，如干擾素-γ( IFN- γ)、血小板衍生生長因子( PDGF)、α- 腫瘤壞死因子(TNF-α)等從而進一步導致肺纖維化的形成，加重肺損傷。

Rho/Rock信號通路

一、Rho/Rock信號通路構(gòu)成

Rho /Rock信號通路是普遍存在于機體組織中可使多種細胞轉(zhuǎn)變成纖維母細胞的信號通路，其中起決定性作用的信號分子有3種，分別是RhoGTP酶、Rock蛋白和肌球蛋白磷酸酶。

作為“分子開關(guān)”的RhoGTP酶，包含：Rho( A-C) 、Rac、Cdc42等，它們均屬于小分子質(zhì)量的G蛋白，控制多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑。它的主要功能是使活性類型(GTP結(jié)合狀態(tài))和失活類型(GDP結(jié)合狀態(tài))二者間相互轉(zhuǎn)換，同時還可啟動并激活下游的激酶級聯(lián)反應(yīng)[10]。Rock蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其分子結(jié)構(gòu)包括兩個區(qū)域：氨基端催化結(jié)構(gòu)域和羧基端pH結(jié)構(gòu)域，它有兩種類型：Rock1(ROKβ)和Rock2(ROKα)，二者在不同組織中廣泛表達，Rock1mRNA主要表達在肺、肝、脾、腎和睪丸等器官中，Rock2mRNA在心腦等器官中高度表達，Rock1和Rock2具有極高的同源性，其氨基酸序列的同源性約為65%，激酶結(jié)構(gòu)域的同源性約為94%。RhoGTP酶通過與Rock蛋白的Rho結(jié)合域(RBD)相互作用，使Rock蛋白活化從而改變其分子內(nèi)“封閉”構(gòu)象[11]。Rock蛋白作為該通路下游最主要的靶向效應(yīng)分子，Rho傳遞信號刺激并活化Rock蛋白，使其下游產(chǎn)生一系列的磷酸化或去磷酸化反應(yīng)。肌球蛋白磷酸酶是Rho/Rock 信號通路的下游標志物，其磷酸化水平增強反映了該通路處于高活化狀態(tài)。Rho使Rock蛋白活化產(chǎn)生活化底物肌球蛋白磷酸酶，又使其磷酸化，進而參與了細胞的收縮、趨化、粘附、浸潤、增殖、凋亡等各式各樣的生物學行為[12]。

二、Rho/Rock信號通路與器官纖維化

1 Rho/Rock信號通路與心肝腎器官的纖維化

已有許多研究結(jié)果證實，Rho/Rock信號通路可能通過炎癥損傷反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞骨架、改變細胞結(jié)構(gòu)、刺激上皮細胞間質(zhì)分化等方式，參與到多種器官纖維化的產(chǎn)生和發(fā)展，如：心臟纖維化、腎纖維化、肝纖維化等，因此可以推斷Rho/Rock信號通路參與多器官纖維化的形成。

2 Rho/Rock信號通路與肺纖維化

有研究表明，Rho/Rock 信號通路與肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，而氧化應(yīng)激損傷是肺纖維化形成的首發(fā)機制。部分研究指出阻斷Rho /Rock信號通路能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，進一步體現(xiàn)了該通路參與到氧化應(yīng)激反應(yīng)的過程中，通過阻礙肺氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，進而干預(yù)肺纖維化的形成[10]。李貴芝等[13]等動物實驗闡明，抑制Rho/Rock 信號通路可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少活性氧簇的生成，從而提高超氧化物歧化酶的活性，減輕或阻礙肺纖維的產(chǎn)生和發(fā)展。Wang等[14]通過用法舒地爾治療急性肺損傷的Wistar大鼠，Rho和Rock1的表達顯著下調(diào)，超氧化物歧化酶活性增加，肌球蛋白磷酸酶靶向亞單位在肺組織中的磷酸化水平明顯降低。張麗娟等[15]研究結(jié)果顯示，Rho/Rock信號通路導致矽肺纖維化的過程中有TGF-β，α-SMA、PDGF等多種細胞因子的參與，但具體機制要進一步探討，抑制Rho/Rock信號通路可以減少相關(guān)促纖維化細胞因子的生成進一步影響肺纖維化的產(chǎn)生。Bei等[16]學者通過次氯酸誘導的系統(tǒng)性硬化癥致肺纖維化的雌性C57BL/6鼠，觀察到應(yīng)用法舒地爾的實驗組炎性細胞、肺纖維化水平降低，不僅活性氧簇降低且α-平滑激動蛋白合成也相應(yīng)減少。而高艷闡述的觀點[17]進一步論證了Rho/ROCK信號通路參與肺纖維化產(chǎn)生和發(fā)展的過程中，多種致肺纖維化細胞因子，如TGF-β、CTGF、α-SMA等，均與該通路有密切聯(lián)系。

法舒地爾

一、法舒地爾的藥理作用

法舒地爾(Fasudil)作為一種新型高效5-異喹啉磺胺衍生物，于上個世紀末由日本旭化成株式會社聯(lián)合名古屋大學共同研制發(fā)明，同時在日本被批準可應(yīng)用于臨床治療。2001年8月經(jīng)我國注冊批準后允許進口使用。作為唯一應(yīng)用于臨床的Rho/Rock信號通路激酶抑制劑，法舒地爾主要在Rho激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點與ATP產(chǎn)生競爭從而抑制Rho激酶的生物活性[18]，減少肌球蛋白輕鏈磷酸酶的磷酸化水平，增加其活性，減少炎性因子的生成，拮抗Ca2+,使內(nèi)皮細胞的張力下降，擴張血管，達到改善血流動力學的目的，從而預(yù)防缺血再灌注損傷，提高組織的微循環(huán)，保護神經(jīng)和細胞，減少細胞的凋亡，也可以減少脂質(zhì)的沉積起到緩解血管粥樣硬化的作用[13]。當前法舒地爾作為有效的血管擴張藥物，主要應(yīng)用于一些腦缺血性疾病的防治，例如蛛網(wǎng)膜下腔出血的腦血管痙攣、慢性缺血性腦血管痙攣等。隨著對法舒地爾不斷深入的研究，眾多研究成果表明，法舒地爾的臨床應(yīng)用不僅僅局限于腦血管疾病，也可減輕多臟器損傷、緩解并改善肺臟、肝臟、心臟、腎臟纖維化的程度。

二、法舒地爾干預(yù)百草枯肺纖維化

Zhang等[19]大鼠動物實驗結(jié)果表明，腹腔注射法舒地爾的百草枯中毒大鼠，Rho、Rock蛋白表達水平、氧化應(yīng)激損傷水平明顯降低，肺組織病理提示實驗組較對照組炎性細胞數(shù)量顯著減少，實驗組肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子、白介素等相關(guān)因子含量較對照組明顯減少。同時該實驗結(jié)果也得出，高濃度法舒地爾干預(yù)組較低濃度法舒地爾干預(yù)組對于百草枯中毒大鼠的肺損傷具有更為顯著的保護作用，但仍需擴大樣本量進一步論證。周挺等[20]動物實驗研究顯示，用法舒地爾干預(yù)的百草枯中毒大鼠，TGF-β1mRNA及其蛋白的表達較百草枯中毒組大鼠明顯下降，進一步證實了法舒地爾通過阻斷Rho/Rock激酶信號通路減少TGF-β1促纖維化因子的產(chǎn)生，從而減輕肺纖維化的程度。何旭娟[21]等研究結(jié)果表明，法舒地爾可降低百草枯中毒大鼠肺纖維化中α-SMA的含量，前期可減輕百草枯導致的急性肺損傷，同時影響后期百草枯肺纖維化的形成。方建江等[22]實驗結(jié)果再次論證了，通過RealtimePCR、Western-blot測定CTGF、Rock1mRNA和蛋白的表達，進一步證實了法舒地爾通過干預(yù)Rho/Rock信號通路，減少百草枯中毒大鼠CTGF含量，緩解大鼠肺纖維化程度。夏菁等學者[23]為評價Rho激酶抑制劑干預(yù)百草枯中毒SD大鼠的效果，通過觀察肺的形態(tài)學、測定CTGF和TGF-β1蛋白表達，得出Rho激酶抑制可抑制TGF-β1和CTGF蛋白的表達，提示Rho激酶抑制劑對百草枯中毒大鼠肺纖維化的治療有潛在價值。綜上所述，法舒地爾通過抑制Rho/Rock信號通路，干預(yù)百草枯肺纖維化形成的多種機制，從而影響晚期肺纖維化。

結(jié) 論

現(xiàn)國家已經(jīng)明令禁止生產(chǎn)百草枯水劑，但由于庫存量大及其他劑型的生產(chǎn)，各地區(qū)急診科仍會接診大量百草枯的中毒患者，其中大部分患者死于急性肺損傷及晚期肺纖維化所致的呼吸衰竭。目前，百草枯中毒尚無明確有用的治愈方法，臨床上以抗氧化和抗炎的傳統(tǒng)治療為主[24]。現(xiàn)大量研究表明Rho/Rock信號通路與多器官纖維化產(chǎn)生有密切關(guān)系，法舒地爾在抑制器官纖維化的產(chǎn)生和發(fā)展過程中起到了有效作用，更為百草枯肺纖維化的臨床治療提供了一個新的思路和治療手段。