武營雪，康帥，劉靜，戴忠，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分[1]，又名折耳根，主要分布于我國中部、東南及西南各省。其味辛、性寒，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效。魚腥草中含有揮發(fā)油、黃酮和生物堿類等成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性[2-5]。其中生物堿類成分有70 多種，主要包括阿樸菲型生物堿、馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿、酰胺類生物堿、吡啶類生物堿和其他類生物堿[6]。2017 年，一項馬兜鈴酸及其衍生物與肝癌相關(guān)的研究引起了人們對馬兜鈴酸類成分的廣泛關(guān)注[7]。馬兜鈴酸類成分為結(jié)構(gòu)相似的一類物質(zhì)，包括各種馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分。馬兜鈴酸在體內(nèi)代謝可產(chǎn)生馬兜鈴內(nèi)酰胺，自然界中也存在馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分[8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ具有明確的腎毒性和致癌性，但對于馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的安全性研究還不充分[9-11]。Chan 等[12]利用高靈敏度和高選擇性的液相色譜-質(zhì)聯(lián)法（LC-MS/MS）未在魚腥草中檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ（檢出限為2 ng·g-1）。陳宏降等[13]發(fā)現(xiàn)，魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分和根莖95%乙醇提取物對斑馬魚成魚和胚胎具有一定的急性毒性和胚胎發(fā)育毒性，半數(shù)致死量（LD50）分別為2.85、10.40、2.54、1.19 mg·L-1，致畸的主要表現(xiàn)為心包水腫和卵黃囊水腫；同時研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ和三白草內(nèi)酰胺0.5 mg·L-1可導(dǎo)致斑馬魚胚胎腎包膜水腫。研究者從魚腥草中分離出馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅡ和胡椒內(nèi)酰胺B、胡椒內(nèi)酰胺D 等馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分，但是對于其含量和毒性的研究都比較缺乏[14-17]。

本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）對不同產(chǎn)地野生或種植的魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分進(jìn)行含量測定研究，為魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分后續(xù)安全性研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC MS-8050 型超高效液相色譜-質(zhì)譜儀（日本島津公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mili-Q 型純水儀（美國密理博公司）；Sartorius MSA6.6S-CE 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；XS105 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；11B S025 型粉碎機(jī)（德國IKA公司）。

1.2 試藥

對照品馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ（批號：X27S11L-125977，純度：98%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ（批號：X09M11-L112632，純度：98%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ（批號：X09M11-112631，純度：97%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（美國Fisher Chemical公司）；乙腈（德國Merck 公司）；甲酸（賽默飛世爾科技有限公司）。

魚腥草藥材購自河北安國中藥材市場、安徽亳州藥材市場和四川成都，共14 批，編號分別為S1～S14，見表1。經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所中藥標(biāo)本館康帥副研究員鑒定為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的干燥地上部分。

表1 魚腥草樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取魚腥草樣品粉碎，取約0.20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（300 W，40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，放置30 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ適量，精密稱定，加甲醇制成含馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ111.7 μg·mL-1、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ72.9 μg·mL-1和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ269.7 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%甲酸（31∶69）為流動相，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，霧化氣流速為3 L·min-1，干燥氣流速為9 L·min-1，加熱氣流速為10 L·min-1，加熱模塊溫度為400 ℃，脫溶劑管溫度為250 ℃，離子源溫度為300 ℃，正離子采集模式，待測化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2，混合對照品及樣品離子流色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液和魚腥草供試品溶液的離子流圖

表2 待測化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質(zhì)量濃度，搖勻，制得系列混合對照品溶液，依2.3和2.4項下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以定量離子峰面積（Y）對分析物質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。將混合對照品溶液進(jìn)一步稀釋，以信噪比（S/N）=10 的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為定量限（LOQ），以S/N=3 的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為檢測限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺成分的回歸方程、線性范圍、LOD、LOQ

2.5.2精密度試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，連續(xù)3 d 進(jìn)樣，測得各成分的峰面積，計算日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD。結(jié)果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的日內(nèi)精密度RSD分別為2.66%、0.79%和0.73%，日間精密度RSD分別為3.35%、1.79%和0.85%。結(jié)果表明該儀器及方法的精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按2.3 和2.4 項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測得各成分峰面積的RSD。結(jié)果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ峰面積的RSD 分別為2.56%、0.73%和0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4重復(fù)性試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備6 份供試品溶液，按2.3 和2.4 項下色譜及質(zhì)譜進(jìn)行條件測定，每份進(jìn)樣3 針，測得各成分的平均含量和RSD。結(jié)果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.964、2.364、9.718 μg·g-1，RSD 分別為3.94%、5.36%、4.41%，該方法重復(fù)性良好。

2.5.5加樣回收率試驗 精密量取對照品適量，配制成一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，取已知含量的S14樣品9份，每份約0.1 g，分成3組，分別精密加入相當(dāng)于樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%（低）、100%（中）、120%（高）的混合對照品溶液，按2.1項方法下制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質(zhì)譜進(jìn)行條件測定，每份進(jìn)樣3 針，測定各成分的峰面積，并計算3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的平均回收率，結(jié)果見表4，加樣回收率為83.77%～105.61%，RSD 為1.14%～11.46%，符合方法學(xué)要求。

表4 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分加樣回收率結(jié)果

2.6 樣品含量測定

取不同批號的樣品0.2 g，精密稱定，按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，每份進(jìn)樣3 針，測定各成分的峰面積，計算魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的含量，結(jié)果見表5。

表5 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）μg·g-1

表5 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）μg·g-1

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

2.7.1箱線圖和差異性分析 采用SPSS 26.0 數(shù)據(jù)處理軟件對測定結(jié)果進(jìn)行處理，對14 批魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分含量進(jìn)行分析，繪制箱線圖（圖2）。結(jié)果表明，樣品S13（湖北野生）中3 個成分的含量較高；其余樣品中馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.757～14.692 μg·g-1；馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.418～10.305 μg·g-1，馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.893～28.339 μg·g-1。

圖2 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的箱線圖

采用SPSS 26.0數(shù)據(jù)處理軟件，單因素方差分析的方法對魚腥草種植（10批）和野生（4批）樣品中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量進(jìn)行差異性分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；對5個不同省份產(chǎn)魚腥草樣品中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量進(jìn)行差異性分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7.2聚類分析 將14批不同來源魚腥草樣品3個馬兜鈴內(nèi)酰胺成分的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，選用組間聯(lián)接聚類方法，以歐氏平方距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)歐氏平方距離為25 時，所有樣品首先聚為兩大類，S13（湖北野生）聚為Ⅱ類，其余13 個樣品聚為Ⅰ類；當(dāng)歐氏平方距離為4 時，Ⅰ類可分為2 個小類，S11（四川種植）樣品聚為Ⅰb 類，其余樣品為Ⅰa類；當(dāng)歐氏平均距離為2 時，Ⅰa 類可分為2 類，S2（湖北恩施種植）、S4（湖北十堰種植）和S8（四川廣漢種植）為一類，其余樣品為另一類。

圖3 不同來源魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量聚類分析

2.7.3主成分分析（PCA）將14批樣品中3個成分含量的平均值為變量，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA，前2個主成分累積方差貢獻(xiàn)率為98%，其中第一主成分（PC1）方差貢獻(xiàn)率為95.5%，第二主成分（PC2）方差貢獻(xiàn)率為2.47%，見圖4，圖中每個點代表1個樣品，與聚類分析的分類結(jié)果基本一致。

圖4 不同來源魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量PCA

2.7.4相關(guān)性分析 利用SPSS 26.0 對3 種成分含量的相關(guān)性分析，結(jié)果見表6，馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的含量之間存在顯著相關(guān)關(guān)系。

表6 魚腥草中3種馬兜鈴內(nèi)酰胺成分相關(guān)性分析

3 討論

3.1 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

分別考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·mL-1乙酸銨）流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不加乙酸銨的溶劑系統(tǒng)靈敏度高，色譜峰型好。本實驗用UPLC-MS/MS 對馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分定量，均采用MRM 模式。將3個馬兜鈴內(nèi)酰胺分別在正、負(fù)離子模式下檢測，待測物在正離子模式下更穩(wěn)定、靈敏度更高；在正離子模式下檢測，同時獲取母離子和子離子信息，并且優(yōu)選出最佳碰撞電壓。與紫外檢測器相比，MRM模式靈敏度高，適合于微量物質(zhì)的分析。

3.2 馬兜鈴內(nèi)酰胺質(zhì)譜裂解分析

根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的最佳離子對為m/z266→251，為[M-CH3+H]+峰，定性離子m/z195為[M-CH3+H-2CO]+峰；馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ與馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ是同分異構(gòu)體，定量離子與定性離子相同；馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的最佳離子對為m/z280→264，為[M-CH4+H]+峰，定性離子m/z236 為[M-CH4-CO+H]+峰；以上的質(zhì)譜裂解特征是UPLC-MS/MS 定量分析識別檢測成分的信號特征，構(gòu)成采用UPLC-MS/MS 檢測馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的理論基礎(chǔ)[18]。

3.3 魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿含量相關(guān)性分析

經(jīng)差異性分析魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿含量發(fā)現(xiàn)，含量與魚腥草的產(chǎn)地、野生或種植無關(guān)，可能與采集時間、儲藏條件和植株高度等其他影響因素有關(guān)；聚類分析和PCA 結(jié)果一致，收集的14個樣本中湖北野生（S13）各成分含量最高；相關(guān)性分析表明，3個成分的含量之間呈顯著正相關(guān)，能夠為其后續(xù)質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇及兼顧經(jīng)濟(jì)適用性方面提供參考。

本研究建立UPLC-MS/MS 測定魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量的方法，發(fā)現(xiàn)14 批魚腥草樣品中馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.757～19.538、1.418～15.971、2.893～70.131 μg·g-1，為后續(xù)魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的安全性研究提供參考。該方法簡便、快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，可為其他藥用植物中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的測定提供參考。